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【摘要】 目的 探讨缺血性脑损伤中HSP72对大鼠神经元的保护作用及其分子机制。方法 将SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注对照组、热休克处理组、HSP72反义寡核苷酸组及溶剂组。采用焦油紫染色、免疫印迹检测大鼠缺血再灌注后海马神经元损伤和脑组织AKT、Bad(Ser 136)的磷酸化情况。结果 热休克处理组与缺血再灌注对照组、HSP72反义寡核苷酸组和溶剂组相比海马神经元损伤减轻，脑组织AKT和Bad(Ser 136)磷酸化升高(P[1-2]。手术第2天于动物清醒状态下结扎双侧颈总动脉，使全脑缺血15 min，然后不同的时间再灌注。缺血时保持其直肠温度在36．5℃～37．5℃。以缺血动物体征表现判断缺血模型的可靠性。假手术组的处理同实验组，但不结扎双侧颈总动脉。热休克处理组于缺血前2 h置于42℃温箱中热休克预处理40 min，HSP72反义寡核苷酸组在热休克预处理的同时腹腔注射HSP72反义寡核苷酸0．5 ml（5’-TGTTTTCTTGGCCAT-3’,浓度200 μmol/L）[3]。�
1．2．2样品制备和免疫印迹 甲组于再灌注第5天，以水合氯醛麻醉大鼠，然后以生理盐水和4%多聚甲醛进行心室灌注[1]。取脑组织在4℃多聚甲醛中固定1 d以上后，于梯度乙醇溶液中脱水并在二甲苯中透明。包蜡后的脑组织进行切片(5 μm)，经脱蜡、二甲苯，最后放于焦油紫溶液中染色。取海马CA1区1 mm 内的细胞数量作为计数标准。乙组于再灌注12 h将大鼠快速断头取脑，分离双侧海马，置液氮中冻存备用。以下操作均在冰水浴中进行。从液氮中取出海马，加1．7 ml匀浆缓冲液，用Teflon匀浆器高速匀浆（10 s×6次），800 g×10 min离心，弃上清液，加入0．6 ml buffer B振荡摇匀，12 000 g×10 min离心，取上清，按改良Lowry法，以牛血清白蛋白为标准蛋白测蛋白后分装，置-80℃冰箱待用。按Sambrook等方法，等量蛋白样品经7．5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，以湿转法电转移至NC膜上。转移后的NC膜经3% BSA室温封闭3 h后加入一抗AKT和Bad(Ser 136)，4℃过夜。用洗涤液洗膜3遍，加入二抗羊抗兔IgG-AP（Sigma公司），37℃反应2 h，洗膜。以NBT/BCIP显色，水洗终止反应。结果用图像处理仪（Gene Company）分析处理。�
1．2．3 统计学方法 采用SPSS 10．0统计软件，计量资料以均值±标准差(x±s)表示，统计分析采用方差分析(ANOVA)。P≤0．05为差异有统计学意义。�
2 结果�
HSP72能减少海马神经元损伤及脑组织AKT和Bad(Ser 136)的磷酸化程度。见表1。�
3 讨论�
研究证实:与假手术组比较，缺血再灌注组第5天海马神经元损伤严重；再灌注12 h脑组织中AKT和Bad(Ser 136)的磷酸化程度显著增高(P[1-2]。故本实验仅取甲组的存活神经元数、存活量表示大鼠海马CA1区神经元细胞存活情况，用乙组的AKT和Bad(Ser 136)数值表示大鼠AKT和Bad(ser 136)的磷酸化情况。�
HSP是生物体细胞在一系列应激因素作用下产生,是具有高度保守性的细胞保护性蛋白质,其中HSP70家族与细胞保护之间的关系最密切,它在机体细胞耐受、机体免疫调节、遗传物质保护、基因调控、细胞增殖分化、肿瘤发生发展等过程中起重要作用。HSP70家族主要有诱导型的HSP72和结构型的HSP73两个亚型,在应激过程中主要为HSP72表达变化[4-5]。脑海马CA1区是对缺血最为敏感而发生大量细胞凋亡的区域之一[2],本实验通过焦油紫染色法检测海马CA1区神经元的凋亡情况证实了这一点。在本实验结果显示：热休克处理组海马CA1区神经元凋亡明显少于缺血再灌注对照组、HSP72反义寡核苷酸组，说明HSP72对脑缺血再灌注引起的海马CA1区神经元凋亡具有很好的保护作用。�
激活后的Akt能使底物中的丝氨酸、苏氨酸残基磷酸化而起到抗凋亡和保护细胞的作用。目前认为，磷酸化后的Akt可通过作用于Bad、Caspase 9等底物或下游因子抑制细胞凋亡[6-8]。近年来研究表明, Akt活化后能经多种途径促进细胞存活,其重要机制之一就是通过磷酸化 Bcl-2家族成员Bad实现其促进生长的作用。Bad是否磷酸化关系到细胞的成活和死亡,是神经存活因子控制神经细胞凋亡的重要环节。Bad的功能受它的Ser-112和Ser-136位点磷酸化所调节。磷酸化的Bad能与伴侣蛋白(Chaperone)14-3-3蛋白相互作用,Bad-14-3-3结合物可释放Bcl-2和/或 Bcl-xl,发挥抗细胞凋亡效应。Akt是强有力的Bad（Ser-136）激酶,活化的 Akt可以使Bad的Ser-136位点磷酸化,有效阻断 Bad诱导的细胞死亡[9,10]。本实验研究发现，脑缺血再灌注后15 min时脑组织中Akt和Bad(Ser 136)的磷酸化程度相对假手术组明显降低，30 min时开始升高，3 h时达到最高，而后逐渐降低，到12 h时回到与假手术组相近的水平，实验证实这一回落导致了细胞严重损伤[2]。为进一步探索HSP72对缺血性脑损伤的保护作用是否与Akt信号通路有关，在实验中笔者使用免疫印迹方法检测各组大鼠脑海马组织中Akt和Bad(Ser136)磷酸化水平。发现热休克处理组的磷酸化水平明显高于其他组，因而推测Akt信号通路可能介导HSP72对神经元的保护作用。�
本实验结果证明:HSP72可以明显上调Akt和Bad(Ser136)的磷酸化水平,减少神经元凋亡,对脑缺血再灌注损伤起保护作用。关于HSP72的脑保护作用的其他可能机制笔者将做进一步的研究。�
参考文献
［1］ 宋远见,裴冬生,孙亚峰,等.脑缺血再灌注后依达拉奉联合黄芪对大鼠神经元的保护作用及机制.山东医药,2008,48(22):6-8.�
［2］ Wang X T,Pei D S,Xu J,et al.Opposing effects of Bad phosphorylation at two distinct sites by JNK1 and JNK3 on ischemic brain injury.Cell Signal,2007,19(9):1844-1856.�
［3］ Nikaido H,Tsunoda H,Nishimura Y,et al.Potential role for heat shock protein 72 in antagonizing cerebral vasospasm after rat subarachnoid hemorrhage. Circulation,2004,110(13):1839-1846.�
［4］ 唐忠志,翁少凡,彭森，等.高温训练对士兵血液及淋巴细胞 HSP72表达的影响. 中国急救医学,2008,28(8):698-701.�
［5］ TavariaM,Gabriele T,Kola I,et al.A hitchhickers guide to the human hsp70 family.Cell Stress Chaperones,1996,1:23-28.�
［6］ Xu J,Li C,Yin XH,et al.Additive neuroprotection of GABA A and GABA B receptor agonists in cerebral ischemic injury via PI-3K/Akt pathway inhibiting the ASK1-JNK cascade. Neuropharmacology,2008，54(7):1029-1040.�
［7］ Gao X,Zhang H,Takahashi T,et al.The Akt signaling pathway contributes to postconditioning’s protection against stroke; the protection is associated with the MAPK and PKC pathways.J Neurochem,2008，105(3):943-955.�
［8］ Wu DN,Pei DS,Wang Q,et al.Down-regulation of PTEN by sodium orthovanadate inhibits ASK1 activation via PI3-K/Akt during cerebral ischemia in rat hippocampus.Neurosci Lett,2006，404(1-2):98-102.�
［9］ 韩彩萍.PI3K/AKT信号通路与脑缺血神经细胞凋亡.国际神经病学神经外科学杂志,2006,33(1):88-91.�
［10］ Miao B,Yin XH,Pei DS.Neuroprotective effects of preconditioning ischemia on ischemic brain injury through down-regulating activation of JNK1/2 via N-methyl-D-aspartate receptor-mediated Akt1 activation. J Biol Chem， 2005， 280(23):21693-21699.�
