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[摘要] 目的 观察姜黄素对膀胱肿瘤T24细胞中胰岛素样生长因子-1（IGF-1）表达的影响。方法 用不同浓度的姜黄素作用于膀胱肿瘤细胞株T24，用MTT法测定细胞抑制率，用流式细胞仪测定细胞凋亡结果，用RT-PCR测定不同姜黄素浓度对肿瘤细胞株胰岛素样生长因子-1（IGF-1）及胰岛素样生长因子-1受体（IGF-1R）mRNA表达量的影响。结果 姜黄素对膀胱肿瘤细胞株的作用具有时间和剂量依从性，姜黄素能够诱导膀胱肿瘤细胞株凋亡，姜黄素可使肿瘤细胞株的IGF-1 mRNA表达量降低。结论 姜黄素可能会通过胰岛素样生长因子-1（IGF-1）通路抑制膀胱肿瘤T24细胞的生长，促进其凋亡。
[关键词] 膀胱肿瘤； 姜黄素； 胰岛素样生长因子-1（IGF-1）
[中图分类号] R737.14 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2009）13-36-02
The Effect of Curcumin on Insulin-like Growth Factor-1 Action in T24 Human Bladder Tumor Cells
GUO Zhiqiang1 LIU Hongyao1 ZHANG Huaping2 XING Tao1
1.The First Hospital of Shanxi Medical University；2.Shanxi Medical University，Taiyuan 030001
[Abstract] ObjectiveTo observe the effect of curcumin on insulin-like growth factor-1 action in T24 human bladder tumor cells. MethodsThe bladder tumor cell lines were administered differ concentration of curcumin. The rate of cell inhibition，the rate of apoptosis and express of IGF-1and IGF-1R mRNA were determined with MTT，flow cytometer and RT-PCR，respectively. ResultsEither the rate of cell inhibition or the rates of apoptosis depend on the curcumin dose and the action time of curcumin. The quantity IGF-1 mRNA was reduced when the curcumin doses increased. ConclusionThe curcumin can depress the growth and enhance the apoptosis on insulin-like growth factor-1 action in T24 human bladder tumor cells.
[Key Words]Bladder neoplasm； Curcumin； Insulin-like growth factor-1
胰岛素样生长因子家族（Insulin-like Growth Factor，IGFs）是一类具有促进细胞增殖、分化以及血管形成等多种生物活性的多肽生长因子，IGF-1及其IGF-1R是该家族的重要成员，两者与多种肿瘤的发生、发展有密切关系。姜黄素（Curcumin）是从姜科植物中提取的一种酚性色素，在其他肿瘤治疗性研究中表明，与以往化学治疗药物较单一的作用途径相比，它具有抗氧化、抗突变、抗促癌和抗炎症等多方面的作用。但有关姜黄素的机制方面，特别是对膀胱肿瘤IGF-1通路影响的研究鲜有报道。本文初步探讨了姜黄素在膀胱肿瘤中对IGF-1通路的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株 膀胱癌细胞株T24人膀胱移形细胞癌细胞，购自中国科学院上海细胞生化所。
1.1.2 实验设备及仪器 超净工作台，苏州市汉达工业自动化有限公司；二氧化碳培养箱，Asheville NC USA；倒置显微镜，奥特光学；酶标定量仪，BIO-RAD NOVAPATH MICROPLATE READER；流式细胞仪，BD FACSCalibur；低速离心机，北京市医用离心机厂；培养板（96孔，24孔，6孔），Costar公司。
1.1.3 药物 小牛血清、RPMI 1640液，Gibco公司；噻唑蓝，上海化学试剂厂；二甲基亚枫（DMSO），上海化学试剂厂；姜黄素，Sigma公司；重组人IGF-1，Peprotech公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 T24细胞置于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，于37℃、5%Co2培养箱中培养，每2天更换培养液一次。细胞传代时，先弃去培养液，PBS洗两次，加入适量的0.25%胰蛋白酶消化并制成单细胞悬液，分装培养瓶中，并加入适量培养液。均取对数生长期中状态良好的细胞用于试验。
1.2.2 MTT比色法分析细胞活力 取对数生长期中状态良好的T24细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，调整细胞浓度为5×104/mL，以每孔100μl（5000个/孔）接种于96孔板，培养24h贴壁后加入含有不同浓度的姜黄素和IGF-1的培养液。IGF-1的浓度依次为50、40、20、10、5、2ng/mL，姜黄素的浓度依次取80、40、20μM。规定时间继续培养后，每孔加入0.5mg/mLMTT，37℃培养3～4h，弃去培养液，每孔加入100μl二甲基亚砜（DMSO），用酶标仪在波长为595nm下测定光密度值，参考波长为655nm。每组试验做3次重复，每个处理做4个平行样。实验结果按公式计算：细胞存活率=（OD实验组-OD空白组/OD对照组-OD空白组）×100%。
1.2.3 Annexin V-PI双染检测细胞凋亡 取对数生长期的细胞，以4×105个/孔接种于6孔板，培养24h后，弃去培养基加入40μM的姜黄素和（或）50ng/mL的IGF-1的培养液，继续培养6h后，0.25%胰酶消化细胞后，用PBS液洗脱细胞，移至离心管，离心后去上清，用PBS液将细胞浓度调整为适宜的浓度后，按Annexin V-PI的说明操作，测定细胞凋亡情况。
1.2.4 RT-PCR法测定姜黄素对膀胱肿瘤细胞IGF-1及IGF-1R mRNA相对表达量 取对数生长期细胞，培养24h后，用不同浓度的姜黄素处理，按规定时间收集悬浮和贴壁细胞，提取培养细胞总的RNA。分别对管家基因（GAPDH）和目的基因（IGF-1基因和IGF-1R基因）制作标准曲线。通过管家基因的校正，检测样品中目的基因的相对表达量。特异性引物采用Primer Premier 5.0 software设计。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下：IGF-1R UP：gTTgggAAggggATCATTTT IGF-1R，DOWN：CATgAAAACCATTggCTgTg；IGF-1 UP：ggCTgAC- CAAgCTgAAACTC，DOWN：ATCgCTTAAACCCAggAggT，将含有引物的PCR反应混合液（25μl）放入SmarteyclerⅡ型PCR仪（TaKaRa，USA）进行PCR扩增反应，PCR反应参数如下：95℃，10s；95℃，5s；60℃，20s，共45个循环。
1.3 统计学方法
所有数据以均数±标准差表示，统计分析采用SPSS 13.0统计软件，组间比较用SNK-q（Student-Newman-Keuls）多重比较检验，量效关系用Spearman等级相关检验，以α= 0.05为检验水准。
2 结果
姜黄素抑制T24细胞生长：使用MTT法分析姜黄素对T24细胞的作用，结果显示姜黄素可以抑制T24细胞的活性，并呈剂量和时间依赖关系。作用24h后，比较对照组，20、40、80μM的姜黄素对IGF-1（50ng/mL）T24细胞的抑制率分别为（26.7±3.44）%、（45.8±2.79）%和（54.9±5.43）%（P＜0.05）。48h后，20、40、80μM的姜黄素对IGF-1（50ng/mL）T24细胞的抑制率分别为（28.6±2.34）%、（47.8±3.16）%和（58.9±4.73）%（P＜0.05），抑制率随培养时间的延长呈增长趋势（P＜0.05）。
姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡：40μM姜黄素作用6h，早期凋亡（AV+/PI）的T24细胞达（13.5±1.06）%，明显高于对照组的（3.4±0.31）%（P＜0.05）。IGF-1（50μg/L）作用组的细胞基本上在第三象限，说明IGF-1具有抗细胞凋亡作用。与姜黄素同时作用后，T24细胞的早期凋亡率分别增至（7.6±1.09）%，与IGF-1（50μg/L）作用组有显著性差异（P＜0.05）。
姜黄素对T24细胞IGF-1与IGF-1R mRNA表达的影响：姜黄素按80、40、20μM/L浓度给药后6h测定细胞IGF-1 mRNA相对与对照组表达量分别为（76.67±1.15）%、（58.51±2.47）%、（42.18±1.94）%（P＜0.05）；IGF-1R mRNA相对表达量为（54.6±2.27）%、（40.12±4.20）%、（23.0±6.50）%（P＜0.05），可见IGF-1与IGF-1R的mRNA表达量随姜黄素的浓度增加而减少（P＜0.05）。
3 讨论
IGF-1是一种多功能细胞因子，参与细胞的生长、发育和分化，具有促进多种细胞生长及增殖的能力。IGF-1在多种组织和细胞中表达，可能与多种肿瘤的发生、发展有关[1]。众多细胞实验和动物实验证实了姜黄素的抗癌活性[2]，大量研究表明姜黄素不仅能够阻遏细胞周期，诱导肿瘤细胞凋亡、分化，还可通过调节多种细胞信号途径抑制细胞生长。夏艳秋等[3]的体外试验表明，姜黄素减弱了IGF-1对MCF-7细胞生长的刺激作用，并且逆转了IGF-1介导的抗凋亡作用。Patel等[4]研究表明，在结肠癌细胞中，姜黄素通过调整EGFR和IGF-1R可以增强5-氟尿嘧啶和奥沙利铂的作用。但是，姜黄素与生长因子IGF-1及其系统的关系尚未阐明，有关姜黄素能否通过调控IGF-1通路抑制肿瘤细胞生长和诱导凋亡值得深入探讨。
本研究以MTT法检测细胞活力作为衡量肿瘤细胞增殖的指标、以Annexin V-PI双染色作为衡量细胞凋亡的指标，探讨姜黄素对IGF-1通路的影响。IGF-1处理后，不仅可明显提高细胞活力、促进T24细胞增殖，还可以抑制细胞凋亡。这些结果均证实IGF-1是肿瘤细胞有丝分裂的重要激活剂[5]，是肿瘤发展的重要刺激因子。更重要的是姜黄素能明显延缓IGF-1促细胞增殖的速度，并抑制IGF-1的抗凋亡作用。提示姜黄素抑制T24细胞增殖，并诱导凋亡作用可能部分通过抑制IGF-1通路作用而实现[6]。另外，无血清培养条件T24细胞均具有一定的增殖能力，这可能依赖于肿瘤细胞本身分泌的IGF-1的刺激作用。上述结果将会对姜黄素抗肿瘤作用机制方面做一定的贡献。
[参考文献]
[1] Bustin SA，Dorudi S，Phillips SM，et al. Local expression of insulin-like growth factor-1 affects angiogenesis in colorectal cancer[J]. Tumour Biol，2002，23（3）：130-138.
[2] Su CC，Lin JG，Li TM，et al. Curcumin-induced apoptosis of human colon cancer colo 205 cells through the production of ROS，Ca2+ and the activation of caspase-3[J]. Anticancer Res，2006，26（6B）：4379-4389.
[3] Xia Y，Jin L，Zhang B，et al. The potentiation of curcumin on insulin-like growth factor-1 action in MCF-7 human breast carcinoma cells[J]. Life Sciences，2007，80（23）：2161-2169.
[4] Patel BB，Sengupta R，Qazi S，et al. Curcumin enhances the effects of 5-fluorouracil and oxaliplatin in mediating growth inhibition of colon cancer cells by modulating EGFR and IGF-1R[J]. Int J Cancer，2008， 122（2）：267-273.
[5] Sachdev D，Yee D. Inhibitors of insulin-like growth factor signaling：a therapeutic approach for breast cancer[J]. Journal of Mammary Gland Biology Neplasia，2006，11（1）：27-39.
[6] Shariat SF，Kim J，Nguyen C，et al. Correlation of preoperative levels of IGF-1 and IGFBP-3 with pathologic parameters and clinical outcome in patients with bladder cancer[J]. Urology，2003，61（2）：359-364.
（收稿日期：2009-01-17）
