【www.zhangdahai.com--教学工作总结】
[摘要] 目的 研究HSP70在兔动脉易损斑块中表达的意义。方法 建立兔动脉粥样硬化易损斑块模型，采用免疫组化技术检测斑块不同部位的HSP70表达情况。结果 兔动脉易损斑块中，热休克蛋白HSP70在纤维帽区平滑肌细胞表现为高表达，与肩部区、脂核区、中膜平滑肌区均有显著性差异：炎细胞在纤维帽区和肩部区HSP70表现为高表达，与其余两区有显著性差异。结论 HSP70参与了动脉粥样硬化斑块形成过程的免疫应答，激活炎症细胞，降低了动脉粥样硬化斑块的稳定性。
[关键词] HSP70；动脉粥样硬化斑块
[中图分类号] R543.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）31-05-02
The Significance of HSP70 Expressed in Rabbit Atherosclerotic Plaques
MENG Fanjie TONG Wenzhen FENG Xiangfei
The Centralab of Yidu Central Hospital of Weifang City, Shangdong Province, Qingzhou 262500, China
[Abstract] Objective To study the meaning of HSP70 expressed in rabbit arteries vulnerable plaque. Methods Atherosclerotic rabbit model of vulnerable plaque was established，and plaques in different parts of the expression of HSP70 were detected using immunohistochemical. Results In vulnerable plaque in the arteries rabbits，HSP70 in the fibrous cap region showed high expression of smooth muscle cells. It had the significance difference with the shoulder area，the fat nuclear area and the tunica media vasorum smooth muscle area；Inflammatory cells in the fibrous cap area and the shoulder region showed high expression of HSP70，it had significant differences with the other two areas. Conclusion HSP70 involved in immune response of atherosclerotic plaque formation process，can active inflammatory cells，reduce atherosclerotic plaque stability.
[Key words] HSP70；Atherosclerotic plaques
动脉粥样硬化是慢性炎症和免疫反应的交互过程[1]。在这一过程中，热休克蛋白（heat shock protein，HSP）作为应邀蛋白参与其中。我们通过动物实验建立易损斑块模型，以研究热休克蛋白在易损斑块中的作用，探讨其作用机制，为动脉粥样硬化斑块的稳定寻求治疗途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 由青岛大学医学院实验动物中心提供健康新西兰纯种大白兔30只，体重1.5～3.0kg，月龄（3.7±1.5）个月，雌雄不限。高脂饮食4个月，分笼按清洁级动物饲养，饮用纯净水，24h通风，室温（23±2）℃。
1.1.2 试剂与药品 抗HSP70单克隆抗体和免疫组化检测试剂盒由上海复兴高科技有限公司提供。
1.2 实验方法
1.2.1 兔动脉粥样硬化斑块模型的制作 在30只兔子高脂饮食1周后，行腹主动脉内膜损伤术，方法如下：用速眠新（0.2～0.3）mL/kg将大白兔肌肉注射麻醉后，右下肢腹股沟和股部备皮，切开皮肤并暴露股动脉至髂外动脉处，上下两端夹以血管夹，切开髂外动脉或股动脉近端约2～3mm，插入3F的Fogarty球囊导管，向心脏方向插入20cm至升主动脉根部，向球囊内充注0.1～0.2mL生理盐水扩张球囊（维持球囊内压力在2个大气压左右），拉回至髂外动脉处。共反复3次。然后用9/0丝线缝合血管，关闭伤口。术中若血管痉挛，可用利多卡因浸泡血管数分钟。若苏醒，可静脉推注盐酸氯胺酮（10～20）mg/kg。术后每日肌注庆大霉素8万单位，连续3d。
兔子饲养4个月后，采用空气栓塞处死，取其腹主动脉，生理盐水冲干净，取其斑块明显处数段，每段约1cm左右，其中一段浸入4%多聚甲醛中固定12～24h，制备石蜡标本。
1.2.2 检查方法 ①形态观察：在光学显微镜下观察动脉斑块的形成情况；②组织切片的制备：选取合适的斑块部位，按以下程序制备切片：固定，包埋，HE染色，然后在显微镜下观察。
1.2.3 观察结果的分区 在光学显微镜下进行观察，将切片分为4个区，依次为：纤维帽区（斑块表面），脂核区（斑块中部），肩部区（斑块与正常血管壁交界处）和中膜平滑肌区（基底部区）。进一步对血管标本沿纵轴进行切割，以分区明显的部位进行标记，根据细胞形态及染色情况来区分不同的细胞。
1.2.4 HSP检测 采用免疫组化技术，严格按试剂盒的操作说明进行。
1.2.5 计算方法 在400倍显微镜下观察5个视野，采用IPP（Image Pro Plus）4.5图像分析软件计算各区中HSP70表达阳性细胞，计算其百分数，即阳性率（为该视野阳性细胞数与细胞总数的比值），取其均值代表每一样本数。
1.2.6 统计学处理 实验数据以（χ±s）表示，应用SAS9.2统计软件包分析，各区间两两比较用Nemenyi法秩和检验。
2 结果
在正常细胞胞浆中，HSP70的表达呈均匀淡紫色，而在阳性表达的细胞胞浆中，其表达呈深浅不一的棕褐色（图1）。在易损斑块的纤维帽区平滑肌细胞表现为HSP70高表达，与肩部区、脂核区、中膜平滑肌区差异均有统计学意义（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05）。炎细胞在纤维帽区和肩部区HSP70表现为高表达，与脂核区、中膜平滑肌区差异均有统计学意义（P均＜0.01）。
3 讨论
热休克蛋白（HSP）是一类具有重要生理功能和高度保守的多肽类蛋白质分子家族，普遍存在于原核和真核细胞中。因受热或其它应激因素（如缺血、缺氧、理化有害刺激等）作用后，发生热休克反应而产生的一类新的蛋白质[2]。其主要生物学功能表现在应激状态下保护细胞生命活动必需的蛋白质，维持细胞生存在细胞生长、发育、分化、基因转录等功能方面发挥重要作用，参与免疫应答等多种生物学功能，也与病毒感染有关[3]。HSP在正常细胞中的表达处于基础水平，当机体受到有害因素（如炎症、紫外线、应急、肿瘤发生等）刺激时，细胞内HSPs合成增加，它能保护机体（或细胞）不受或少受伤害。依据相对分子量的大小可分多个亚家族，包括HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40、小分子HSP和泛素。现认为主要以HSP60、HSP70家族为主，均为免疫显性分子，能激活人体血管内皮细胞表达。研究发现在炎症反应中起核心作用的IL-6[4]，它作为炎症反应的重要介质，能够作用于血管壁，进而引起VEC损伤，导致动脉硬化的发生。
在HSP家族中，目前研究最多的且作用最为重要的一员是HSP70。HSP70具有分子伴侣功能、抗细胞凋亡功能、抗氧化等多种生物学功能，能够参与机体的免疫反应，提高细胞的应激耐受性、促进细胞增殖、参与细胞骨架的形成和修复等。其在机体的应激状态，如缺氧、缺血、热刺激、感染等情况下会大量释放。
本文中，通过制备兔动物易损斑块模型的切片，观察HSP70在不同部位的表达情况。结果发现：在纤维帽区和肩部区，HSP70表现为高度表达，其中在炎细胞中的表达高于平滑肌细胞，原因可能与不同区受到的切应力大小不同有关。因为切变力从斑块表面到基底部逐渐减少，在斑块表面，其受到的切变力最大，最容易破裂；而在基底部，由于受到的切变力最小，最为稳定，因此HSP70表达明显较纤维帽区和肩部区减少。HSP70在平滑肌细胞和炎细胞中的高表达，应与HSP的保护作用和诱发炎症功能有关。
[参考文献]
[1] 张鹏飞，张运，张梅，等. 颈动脉粥样斑块应变及应变率分布的初步探讨[J]. 中华超声影像学杂志，2004，13（8）：573-576.
[2] 褚文政，王维. 热休克蛋白70和缺血性脑损伤[J]. 医学综述，2001，7（12）：759.
[3] 程晓丽，神吉智丈，李春燕，等. 热休克蛋白10和热休克蛋白的60表达、纯化及与线粒体DNA转录因子A相互结合[J]． 郑州大学学报，2007，42（1）：50-52．
[4] Keiko M，Masafumi K，Wu XC，et al．Green tea catechins inhibit the cultured smooth muscle cell invasion through the basement barrier[J]．Atherosclerosis，2003，166（1）：23-30．
（收稿日期：2011-08-23）
