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【摘要】核苷类药物是目前抗乙型肝炎病毒(HBV)的主要药物,但用药后易引起HBV基因组突变而产生耐药性,降低治疗的效果。本文就核苷类药物引起变异的特点、产生抗药性的分子机制及检测等方面作一综述。
【关键词】乙型肝炎病毒;变异;耐药
【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】1006-1959(2009)09-0001-02
目前,广泛应用抗乙肝病毒的药物主要有两类,即a-干扰素和核苷类药物。核苷类药物主要是拉米夫定,它适用于体内HBV复制活跃且滴度较高的慢性乙型肝炎患者的治疗,包括部分对干扰素禁忌活干扰素治疗无效的患者。但该类药需长期服用,且易产生耐药。此类变异株不仅抗药性增加,而且可再次加重肝损害,引起病情反复,甚至加重。因此加强HBV变异的研究,具有重要的生物学及临床意义。
1 HBV耐药变异的基础
乙肝病毒是一个高变异的病毒,在它逆转录复制的过程中,因RNA聚合酶缺乏校正功能,可使病毒在复制过程中发生一个或多个核苷酸的变异。HBV变异可以在慢性持续性感染过程中自然变异,也可以受人体免疫应答和疫苗接种,使病毒受免疫压力而导致变异。发生变异的病毒常改变其生物学特性,给临床的防治带来一系列问题。
HBV复制水平较高,估计HBV病毒颗粒平均每天产生量为1012-13个,由于HBV逆转录酶没有校对功能,一个复制周期中每10�2个核苷酸出现一个错配[1]。这样每天就有1010-11个错配发生。而HBV基因组只有约3200个碱基对,每天每个位点都可能产生任何形式的硷基改变。因此突变产生的速度相当快。治疗前存在各种HBV毒株,包括可能与耐药有关的突变株和存在天然耐药基因。现在临床应用的核苷类药物主要靶点位于P区的逆转录酶RT区的B及C区,HBV多聚酶的催化域是位于C区的YMDD基因。治疗过程中筛选出变异株的可能性主要取决于药物抑制病毒复制的强度,抗病毒作用较弱的药物未对病毒施加明显的选择压力,产生耐药的可能性也不高。相反如果药物能完全抑制病毒复制,产生耐药的概率也就小,因为病毒发生变异是与病毒复制水平有关系。核苷类药物能抑制病毒复制但不能清除病毒,单用一种中等抗病毒作用的药物治疗,且该药物只是针对某一个单独的靶点,那么产生耐药突变的可能性就大大增加。
2 抗乙肝核苷类药物的作用机制
根据HBV在体内复制过程,可以寻找有效抗病毒治疗的靶位[2,3],HBV感染的第一步为病毒核肝细胞的特殊受体结合,脱壳后病毒穿入细胞质,其穿透和脱壳的机制尚不清楚,可能和细胞膜融合无关,或许为受体介导的内吞引作用。第一个关键步骤为病毒基因松弛环状DNA转变为cccDNA及转录为病毒的微型染色体,主要依靠宿主的酶,并以此为模版转录为所有的病毒mRNA。第二个关键步骤为通过前基因组RNA和逆转录酶包装入核心蛋白内,成为复制复合体,病毒多聚酶N端蛋白和pgRNA的5′端独特的RNA附加体结合,酶活化后启动HBV DNA合成,先合成负链,继而合成部分正链。在胞质中装配成完整的病毒释出,部分病毒基因进入细胞核内形成cccDNA。
HBV复制过程中,多数环节依靠宿主酶的活性,仅在个别逆转录合成过程中依靠病毒自身的DNA多聚酶(逆转录酶作用)。所以阻断病毒逆转录酶的作用为当前抗病毒HBV治疗的主要环节[4], 核苷类药物经细胞激酶作用后成为三磷酸化合物,可以选择性竞争抑制病毒多聚酶的活性,整合入病毒DNA后由于其糖分子上缺少3′羟基结构,因而中断了DNA链的延伸。
拉米夫定主要抑制病毒逆转录酶的功能,它们可以和dCTP竞争,成为HBV DNA负链延伸的阻止者。阿德福韦可以阻止dATP和病毒引物段结合,抑制逆转录酶的引发作用,也抑制负链的延伸。恩替卡韦可以同时抑制病毒的引发作用及负链延伸作用。克拉夫定主要抑制HBV DNA正链的合成。特必夫定的作用机制尚不完全了解[5]。
3 对抗病毒药物耐药性机制
3.1 抗HBV治疗耐药的病毒学机制:HBV对核苷类药物耐药是一个很大的问题,耐药性的产生主要由于病毒发生基因突变,产生构型和静电位的改变,从而影响核苷类药物整合入病毒DNA发挥其对病毒的抑制作用。
3.2 抗HBV治疗耐药的细胞学机制:核苷类药物抗HBV 治疗使病毒滴度下降后,肝内有些肝细胞仍有HBV 活跃复制,说明有些细胞因子影响了疗效,但其机制不清。核苷类药物细胞膜转运可能与基质特异性、离子依赖性及抑制因子的敏感性有关。核苷类药物首先要进入肝细胞内经过磷酸化才能发挥作用。其磷酸化过程缓慢,而且其激酶具有基质特异性,静止状态肝细胞内磷酸化激酶活性低,但分解核苷类药物的活性高。有些糖蛋白具有泵出核苷类药物的作用,如MRP4及MRP5可以排除特洛福韦,但是否能引起耐药则不清楚。另外还有一些细胞内的核酸外切酶也可以影响核苷类药物的效果,如肿瘤抑制蛋白p53具有核酸外切酶活性等[6]。
3.3 HBV对核苷类药物抗药性分子机制的假说:逆转录病毒反转录酶的同源性结构模型研究提示,552位置的YMDD基序中蛋氨酸到缬氨酸或异亮氨酸的突变,导致在缬氨酸/异亮氨酸B支链上甲基和拉米夫定环上硫原子之间的空间阻碍。除了减弱将拉米夫定结合至聚合酶的能力外,这种空间阻碍可导致抑制物结合至突变酶上的方向发生改变,这就降低了拉米夫定三磷酸盐掺入复制中的病毒DNA中的效率。空间阻碍所致的抗药性对于所有核苷类药物(拉米夫定)都是个常见的问题。由于脱氧核糖环处于自然的构象,所以这些突变并不影响自然底物脱氧胞苷三磷酸盐的结合力。这样,对自然底物的影响比对拉米夫定的影响要小,聚合酶维持了有所下降的活性水平。对于底物结合,180位置的亮氨酸似乎不起直接的作用。然而,该部位的突变能改变一些邻近氨基酸支链的位置,这就影响了催化部位,其中还包括204位置的氨基酸。因此,在204 位置的L180M突变以及由于这些突变引起的聚合酶活性的减弱,会引起对于拉米夫定抗药性。
4 HBV耐药对临床的影响
拉米夫定所诱导的YMDD变异的比例随服药时间的延长而增加,第1、2、3、4年分别为14%、28%、49%和66%。当变异株成为优势株时,就可能出现耐药。大量的研究表明拉米夫定耐药会导致病毒水平的上升、ALT水平的升高及疾病的进一步发展。拉米夫定耐药还可能会引起肝功能失代偿甚至肝衰竭而死亡。肝硬化患者在长期接受治疗过程中,发生拉米夫定耐药后,会明显发生肝炎活动及肝功能失代偿的风险[7]。
阿德福韦的抗病毒疗效与拉米夫定类似,在长期接受治疗的病例中也发现耐药变异株,但其发生率很低,对于HBeAg阳性病人应用1、2、3年时耐药发生率分别为0% 、1.6%和3.1%。HBeAg阴性患者1、2、3年时耐药发生率分别为0% 、3.0%和5.9%-11%。所有拉米夫定耐药株对阿德福韦均敏感,而阿德福韦耐药株对拉米夫定也敏感。根据阿德福韦初始作用慢,耐药率低的特点,比较适用于肝脏基础稍差的病人,能尽可能减低因病毒变异所造成的病情反复。正是由于阿德福韦有这样的特点,不太适合用于因病毒复制所致的重症肝炎病人,在替代拉米夫定治疗YMDD变异株时,要与拉米夫定重叠使用1-3个月,根据病毒和肝功能的情况调整治疗。
恩替卡韦对拉米夫定耐药性的敏感性低于野生株,对不同变异的病毒株其抗病毒活性降低程度不同,对变异株的敏感性要求恩替卡韦浓度增高。Ⅲ期临床结果显示,对发生YMDD变异者将剂量提高每日1mg能有效抑制HBV DNA复制,对初治患者治疗1年的耐药发生率为5.8%。只有在感染拉米夫定耐药变异株的病人, 才会出现恩替卡韦耐药表型。
5 核苷类药物耐药性检测技术
对于了解核苷类药物的抗药性,体外试验是重要部分。抗核苷类药物对HBV的作用可在实验室通过两种方法得到评估。基因型方法,可帮助发现治疗过程中病毒蛋白质氨基酸序列的改变;表型方法,可证实在临床设置之外药物功能的降低。基因型方法,HBV基因组序列的变化至少可用六种方法检测。聚合酶链反应(PCR)产物直接测序、克隆DNA测序、线性探针分析法、限制性片段长度多态方法、DNA芯片分析和荧光定量PCR曲线分析法。表型方法,在分子水平、细胞水平以及整体水平上检测抗药性的方法已被用于HBV抗药性的研究。包括共价闭合环状DNA(cccDNA)的形成,在感染了病毒颗粒的人类、鸭子以及北美土拨鼠原代肝细胞。高水平的HBV的复制和cccDNA的聚集也可在转导重组的HepG�2细胞(人类肝细胞瘤细胞系)中进行研究。
6 前景展望
HBV快速的复制和聚合反转录酶高度的错误率使病毒产生耐药的突变体。因此尽管拉米夫定和其他核苷类药物在短期内非常有效,然而对大多数患者来说,在这些药物有效除去HBV之前已经有抗药性病毒出现。因此亟待避免产生抗药性的新的治疗方法。这些治疗可能依赖新的细胞因子、聚合酶抑制剂或者这些制剂的联合应用,从而最大限度地抑制病毒复制和潜在的抗药性突变体的产生。随着抗病毒药物的临床应用,HBV 耐药将会成为核苷类药物抗病毒治疗过程中最重要的问题之一。我们必须高度重视预防HBV多重耐药毒株的出现,尽快建立研究HBV耐药的一系列技术平台。联合治疗将是未来治疗慢性乙型肝炎的重要趋势,特别是对于病情较重的患者,如果将有协同作用的药物联合起来,那么不仅可以增强疗效,还可以减少耐药的发生。
参考文献
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[2] Locarnini S. Molecular virology of hepatitis B virus. Semin Liver Dis,2004,24:3-10
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[7] Shaw T, Bartholomeusz A, Locarnini S. HBV drug resistance:mechanisms,detection and interpretation. J Hepatol,2006,44:593-606
