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【摘要】目的将人canstatin cDNA分泌型真核表达载体pSecTag2B/canstatin稳定转染中国仓鼠卵巢（CHO-K1）细胞并获得稳定表达canstatin蛋白产物的细胞株。再进一步研究表达产物的生物学作用。方法将人canstatin cDNA的重组1质粒pSecTag2B/canstatin稳定转染CHO-K1细胞，应用RT-PCR、 western-blotting法检测表达产物，再用多种方法进一步研究canstatin的生物学作用。结果成功的将pSecTag2B/canstatin稳定转染CHO-K1细胞并鉴定出上清液中有目的蛋白的表达。该细胞培养上清液能抑制鸡胚绒毛尿囊膜中微血管的生成，抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC-12）的生长并诱导其凋亡。结论 ①成功的将pSecTag2B/canstatin稳定转染CHO-K1细胞并获得能稳定表达canstatin蛋白产物的细胞株;②证实含canstatin蛋白产物的细胞培养上清液具有抑制鸡胚绒毛尿囊膜微血管生成的活性并可在体外抑制HUVEC-12的生长和诱导其凋亡。�
【关键词】稳定转染；脂质体；鸡胚绒毛尿囊膜实验；生长曲线；流式细胞学技术�
近年来,依据肿瘤生长和转移依赖于血管生成这一基本现象，针对肿瘤血管形成的分子机制所设计的抗血管内皮细胞增殖疗法已成为肿瘤治疗的热点研究领域,血管内皮细胞已成为抗癌治疗的重要靶区。Canstatin是2000年由Kamphaus［1］等发现的一种新的血管生成抑制因子，它具有较强的抑制血管内皮细胞增殖和迁移，诱导内皮细胞凋亡，抑制肿瘤生长的作用［2］。本实验将人canstatin cDNA分泌型真核表达载体pSecTag2B/canstatin稳定转染中国仓鼠卵巢（CHO-K1）细胞以获得稳定表达canstatin蛋白产物的细胞株，再用含canstatin的上清液作用于人脐静脉内皮细胞（HUVEC-12），以便进一步研究canstatin的生物学作用，为探讨canstatin作用机制奠定前期实验基础。�
1材料与方法�
1．1实验材料�
pSecTag2B/canstatin由南华大学肿瘤研究所构建，中国仓鼠卵巢（CHO-K1）细胞购自中南大学湘雅医学院细胞培养中心。人脐静脉内皮细胞（HUVEC-12）由南华大学心血管病研究所馈赠。孵育�7 d的受精鸡胚购自衡阳市角山乡孵化厂。 LipofectamineTM2000脂质体转染试剂：美国Invitrogen公司（华美公司代理）。TaKaRa RT-PCR试剂盒、潮霉素B：宝生物工程（大连）有限公司。western-blotting荧光检测试剂盒：美国Hyclone-prierce公司。6-组胺酸（6-His）抗体由南华大学病原微生物研究所馈赠。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购于武汉博士德公司。引物根据Genebank中报告的序列设计而成，并用Primer Premier5．0软件辅助分析：上游引物：5�- CCCAAGCTTGTCAGCATCGGCTACCTC -3�，下游引物：5�- CGGGATCCCAGGTTCTTCATGCACAC-3�，上下游引物的5�端分别设有Hind III和BamHI酶切位点。PCR引物由大连宝生物公司合成。�
1．2实验分组�
细胞分为重组载体转染组(pSecTag2B/canstatin CHO-K1) 、空载体转染组(pSecTag2B CHO-K1) 及亲代CHO-K1 细胞组(CHO-K1)。�
1．3方法�
1．3．1人canstatin cDNA的分泌型重组质粒稳定转染CHO-K1细胞按照试剂盒说明书，利用LipofectamineTM2000脂质体转染试剂分别将pSecTag和pSecTag/canstatin质粒DNA转染丰度为80％的CHO-K1细胞，根据药物剂量反应分析实验结果，以50 ug/ml潮霉素B浓度进行筛选，挑选出阳性克隆并转移至细胞培养瓶中继续培养。�
1．3．2 RT-PCR 检测canstatin 基因mRNA 的表达引物设计：P1：5�- CCCAAGCTTGTCAGCATCGGCTACCTC -3�；P2：5�- CGGGATCCCAGGTTCTTCATGCACAC-3�。 预计扩增产物长度为684 bp 。将各组细胞用胰蛋白酶消化并离心收集, 用Trizol试剂从细胞中提取总RNA , RT-PCR 检测canstatin 基因mRNA 的表达。反应条件: 94 ℃ 2 min；94 ℃ �40 s，�57 ℃（以57 ℃为中心跑梯度PCR，各管退火温度分别为57．5 ℃、56．5 ℃） 40s，72℃ 1 min，33 Cycle；72 ℃延伸 10 min。1�%�琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。�
1．3．3western�blottiing法检测上清液中重组Canstatin融合蛋白�
将各组细胞常规培养至90%融合，弃培养基，PBS洗涤3次，换1%小牛血清培养24 h收集上清，10 000 r/min，室温离心15 min，取上清液作为样品进行SDS-PAGE 电泳。然后将蛋白电转至硝酸纤维素膜上，用含50 mg/ml BSA的TBST封闭2 h；以6-His单抗IgG为一抗，羊抗兔IgG为二抗。western�blottiing法鉴定canstotin 的表达。用ECL发光法显色，曝光，显影，定影。�
1．3．4检测pSecTag2B/canstatin转染CHO-K1细胞培养上清液生物学作用蛋白样品收集：分别收集常规条件下培养的正常CHO-K1细胞上清液、CHO-K1/(pSecTag2B・canstatin）上清液、CHO-K1/pSecTag2B（空载体）上清液及正常细胞培养基，�1 000 r/min，室温离心5min，取上清液备用。�
1．3．4．1鸡胚绒毛尿囊膜实验取孵育8 d 的受精鸡胚，于照卵灯下寻找胚头，在胚头右下方�0．5~1．0 cm 处开约0．5 cm×0．5 cm的窗口，暴露绒毛尿囊膜，放大镜下对测试区四级血管记数,然后在各组鸡胚的测试区分别滴加0．2 ml蛋白样品，灭菌透明胶带封口后置37 ℃ 、饱和湿度下孵化至第11 d ，观察并记数血管生长情况，数据以均数±标准差(x±s)表示, 进行单因素方差分析。�
1．3．4．2观察细胞形态 用10%小牛血清的RPMI－1640培养基、37 ℃ 、5%CO的条件培养HUVEC-12至对数生长期，弃原培养基，PBS洗涤3次，分别改用收集的各组上清液及正常细胞培养基继续培养48 h。倒置显微镜下观察细胞形态。�
1．3．4．3细胞生长曲线将各组细胞分别用胰蛋白酶消化,加入适量培养基制成细胞悬液计数后,以1×10�5 传代于24 孔细胞培养板中,每组细胞接种21 孔。各组分别改用收集的各组上清液及正常细胞培养基继续培养。每天取3 孔细胞经胰蛋白酶消化后进行细胞计数,取均值描绘细胞生长曲线。�
1．3．4．4流式细胞学技术检测canstatin在体外诱导HUVEC-12凋亡常规培养HUVEC-12至对数生长期。弃原培养基，PBS洗涤3次，各组分别改用收集的各组上清液及正常细胞培养基继续培养�48 h。胰酶消化后离心(1 000 r/min，5 min)收集细胞，弃上清，加入-20 ℃1ml 75%乙醇，充分混匀，放入-20 ℃冰箱保存。样品送至中国中医研究院基础理论研究所流式细胞室检测。�
2结果�
2．1转染的阳性克隆�
药物筛选10 d，维持培养12 d后倒置显微镜下可见细胞聚集成团状生长，克隆生成。(见图1，10×40倍倒置显微镜下摄像)�
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图1aCHO-K1/pSecTag2B/canstatin细胞阳性克隆�
图1bCHO-K1/pSecTag2B细胞阳性克隆
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2．2RT-PCR结果�
转染pSecTag2B/canstatin的细胞在700 bp左右扩增出目的条带，与人canstatin cDNA片段理论长度（684 bp）基本一致。而转染空载体和正常CHO-K1细胞未见目的条带(图2)。�
图2RT-PCR结果
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2．3western-blotting法检测上清液中目的蛋白�
CHO-K1/pSecTag2B/canstatin细胞培养上清液中的表达产物在26 KD 左右有阳性条带显示(图3) ，此蛋白的分子量比实际人Canstatin蛋白分子量（24KD）稍大，这是因为表达的融合蛋白在其N端连接着c-myc表位肽和6－组氨酸尾。而对照组CHO-K1和CHO-K1/pSecTag2B的表达产物，则未见明显的条带。�
图3转染细胞表达产物的western-blotting分析�
A,B,C: CHO-K1,CHO-K1/pSecTag2B,CHO-K1/ pSecTag2B/canstatin�
2．4鸡胚绒毛尿囊膜实验结果�
鸡胚绒毛尿囊膜（CAM ）实验结果显示：对照组血管呈叶状生长，加样后血管密度无降低；而canstatin 蛋白实验组加样后能明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成：给药区及其周围血管明显减少，血管纹理欠清晰，小血管分支少，通过鸡胚处理前后血管生成记数，实验组与对照组之间经统计学处理差异有统计学意义 (P
