【www.zhangdahai.com--开题报告】
[关键词]氨基苷类；耳毒性 临床应用的氨基苷类抗生素能损伤内耳毛细胞，引起患者听力损伤。其损伤机制是在耳蜗中产生自由氧，从而激活毛细胞死亡通路，继发细胞凋亡。目前，保护内耳免受耳毒性药物损伤的策略一，在上游提供抗氧化剂，防止激活细胞死亡通路；策略二，在下游提供阻断活化的细胞死亡通路的阻断剂，中止细胞凋亡。挑战与机遇在保护内耳和维持耳毒性药物疗效中共存。
1活性氧（ROS）
氨基苷类抗生素诱导产生活性氧（ROS）,是引起细胞死亡的一系列反应的开始。氨基苷类抗生素可与铁离子形成鳌合物，与不饱和脂肪酸反应，催化生成活性氧自由基(O2•)和脂类自由基。正常情况下，耳蜗毛细胞内活性氧自由基(O2•)在超氧化物酶(SOD)催化下生成过氧化氢(H2O2)，然后在过氧化氢酶作用下分解成水和O2。氨基苷类抗生素（如庆大霉素）可激活内耳组织中的iNOS，使NO生成增加。这种情况下，活性氧自由基(O2•)可与过量的NO生成有害的过氧化亚硝酸盐，或直接诱导细胞死亡。有研究发现氨基甙类抗生素同时能使体外培养的Corit氏器中抗氧化酶基因表达下调[1]。同时，铁离子可通过Fenton反应催化H2O2生成活性更高的羟自由基(-OH)。庆大霉素能与Fe2+及细胞膜上的磷酯酰肌醇二磷酸（PIP2）形成三元络合物，释放出花生四烯酸（AA）,花生四烯酸再次与Fe2+和庆大霉素形成络合物，后者与氧自由基反应，进一步促进更多花生四烯酸的氧化反应和激活细胞死亡通路；细胞膜上的花生四烯酸可直接与Fe2+和庆大霉素形成络合物，被-OH氧化生成碳基。碳基可直接激活过氧化反应或与O2 结合生成花生四烯酸的负氧粒子根[2]。活性氧（ROS）造成细胞结构（包括细胞膜DNA）损伤，激活耳蜗外毛细胞死亡通路。
氨基苷类抗生素易损伤耳蜗外毛细胞和I型前庭毛细胞，但对内毛细胞和支持细胞没有影响。出现这种情况的一种可能原因是核因子κB（NF-κB）的激活与转录。NF-κB被认为在氧自由基诱导的细胞信号通路中起一定的作用。对大鼠全身给予卡那霉素，通过用免疫染色法检测4-羟基-2-不饱和醛（4-HNE），可以观察到Corit氏器各类细胞中脂类过氧化反应增加，在内毛细胞和支持细胞的细胞核中，NF-κB表达水平升高；在外毛细胞核中缺乏NF-κB表达。这一现象提示NF-κB可能保护内毛细胞和支持细胞免受卡那霉素介导的损伤，而不是内毛细胞和支持细胞对卡那霉素不敏感，同时给予水杨酸盐或2，3-二羟基苯甲酸酯（促进NF-κB在外毛细胞核中的表达）后，外毛细胞损伤减轻[3]。
除了外毛细胞核中NF-κB表达较其它Corit氏器细胞低这一原因外，其胞内抗氧化能力也低于其它细胞也是其中可能的原因。外毛细胞胞浆中还原型谷光苷肽（GSH）水平低于Corit氏器内其它细胞，并且不同部位的外毛细胞中GSH水平也不相同，顶周的外毛细胞胞浆中GSH水平远远高于底周的外毛细胞胞浆中GSH水平[4]。氨基甙类抗生素一般从耳蜗底周破坏外毛细胞，逐渐扩展到中段，至顶周。
2细胞凋亡
过多的自由氧可诱导细胞凋亡。目前有两条公认的凋亡通路：外源性死亡受体介导的凋亡通路；内源性线粒体介导的凋亡通路。目前，这方面的文献研究主要集中在实验周期短的体外细胞株或离体器官培养上，发现内源性凋亡通路是氨基甙类抗生素诱发耳蜗细胞凋亡主要通路（但不能确定是否与长期体内实验接过一致）。内源性凋亡通路的特点是激活G蛋白家族如：Ras, 鸟苷三磷酸酶,Rac。G蛋白又可激活应激活化蛋白激酶家族如细胞分裂素(丝裂原)活化蛋白激酶（MAPK）和c-Jun氨基端激酶（JNK）,同时胞浆内Ca2+浓度升高，细胞色素C从线粒体内释放出来。细胞色素C的释放是由Bax（一种促凋亡蛋白，可改变线粒体膜，开放PTP孔）介导。但最新研究发现肝癌细胞内，ROS可直接通过一种电压依赖性阴离子通道促使细胞色素C的释放。这种阴离子通道可以调控细胞色素C的释放，但细胞色素C的释放并不依赖它[5]。庆大霉素可诱导体外培养的Corit氏器中的外毛细胞凋亡，可检测到线粒体膜电位的变化。加入铁鳌合剂、水杨酸、2，2-联吡啶或环胞菌素A(一种线粒体膜PTP孔阻滞剂)可以部分保护外毛细胞但不能阻止细胞核内染色质的凝集[6]。以上研究表明线粒体释放细胞色素C，然后依次激活Caspases-8,-9,-3是内源性细胞凋亡的主要通路，但还有其他通路存在。
体内、体外实验表明氨基苷类抗生素与内源性细胞凋亡的许多环节都有关系。庆大霉素可激活G蛋白（可被G蛋白阻断剂或特殊的Ras阻断剂阻断）[7]。同时，庆大霉素又可诱导鸟苷三磷酸酶活性增加（可被鸟苷三磷酸酶阻断剂或Ras阻断剂阻断）[8]。G蛋白和鸟苷三磷酸酶的下游底物为应激活化蛋白激酶如c-Jun氨基端激酶（JNK），这类激酶存在于胞浆内，与c-Jun中间反应蛋白（一种支架蛋白，调控激酶的活性）结合。这类蛋白质被认为能够调节JNK的下游底物，使他们易于磷酸化。活化的JNK可激活c-Jun, c-Fos，ELK-1，以及细胞核内转录激活因子2(ATF2)和线粒体膜上的Bcl-2。总之，给予庆大霉素后，耳蜗外毛细胞内JNK，c-Jun，c-Fos和Bcl-2被激活，伴随着胞浆内细胞色素C浓度升高，凋亡的形态学改变[9]。
3 保护策略
氨基苷类抗生素的耳毒性合理的保护策略应是在早期应用抗氧化剂，自由基清除剂，和铁鳌合剂；中后期给予各种凋亡阻滞剂，联合保护耳蜗细胞。
抗氧化保护：
在早期可以应用维生素E、DL-甲硫氨酸、α-类脂酸等阻止ROS的生成或清除已生成的ROS，来减少脂类的过氧化反应和细胞的损伤。还有报道称依布硒啉(消炎镇痛药)能 有效的抗氧化，清除过(氧化)亚硝酸盐，减轻氨基甙类抗生素的耳毒性[10]。
在动物实验中，研究发现地塞米松、水杨酸盐、2，2-联吡啶及2，3-二羟基苯甲酸酯是有效的铁螯合剂，能同氨基苷类抗生素分子竞争，与铁离子结合成络合物，从而阻断氨基苷类抗生素诱导生成ROS[6]。水杨酸、2，3-二羟基苯甲酸酯还能促使NF-κB转录到外毛细胞核中，启动抗凋亡信号通路[3]。
从中草药中提纯的黄酮，包括一大类化合物，具有很强的抗氧化作用，可以提高抗氧化酶的活性，清除ROS，稳定细胞内Ca2+浓度等作用，已在动物实验中证明可拮抗氨基甙类抗生素的耳毒性。
近期研究表明，地塞米松可以通过抑制NO合成酶，减少ROS的生成保护外毛细胞免受氨基甙类抗生素介导的损伤[11]。同期研究还发现神经营养成长因子提高抗氧化酶的活性，抑制NO合成，增强具有抗凋亡作用的Bcl-2的表达，从而抑制诱导凋亡的蛋白的活性。这类因子有很好的应用前景：目前已有报道，对注射庆大霉素的豚鼠进行转化生长因子-β（TGF-β）、胶质细胞神经元营养因子(GDNF)基因治疗，可保护豚鼠的听力[12]。
研究内源性抗氧化物酶，有助于研究氨基甙类抗生素的耳毒性的机制，同时还可以提供新的耳蜗保护方法。研究发现M40403（SOD的类似物）可以保护离体培养的Corit氏器，减轻氨基甙类抗生素的耳毒性，但不能拮抗顺铂的耳毒性。原因可能是顺铂能引起严重的GSH的减少，或打破补充酶系统的平衡，还有可能是顺铂通过ROS之外的途径造成耳蜗的损伤[13]。通过腺病毒载体向豚鼠耳蜗内转导过氧化氢酶，可溶性超氧化物歧化酶（SOD1）和线粒体超氧化物歧化酶（SOD2）对氨基甙类抗生素的耳毒性有部分保护作用，过氧化氢酶和线粒体超氧化物歧化酶（SOD2）的效果好于可溶性超氧化物歧化酶（SOD1）[14]。
增强细胞抵抗力和改变氨基甙类抗生素的药动力学，也可以减小氨基甙类抗生素的耳毒性。在噪音性聋的研究发现，预先给予低强度的声刺激，可以加强豚鼠耳蜗外毛细胞抵抗高强度声刺激的损伤。其机制是增加了胞浆中抗氧化酶的活性。预先给予豚鼠小剂量的卡那霉素可以增强其耳蜗外毛细胞抵抗大剂量的卡那霉素的耳毒性[15]。
袢利尿药可加重氨基甙类抗生素的耳毒性。但有关研究发现，发生庆大霉素中毒的豚鼠，延迟给予利尿酸，能减少外淋巴中重氨基苷类抗生素的浓度，减轻耳蜗损伤的程度。距最后一次给予庆大霉素，12～18 h后给予依地尼酸，可以减轻耳蜗的损伤[16]。
4抗凋亡保护
研究证明氨基苷类抗生素可诱导耳蜗外毛细胞进入前凋亡状态。目前发现一些化合物可以减慢或逆转细胞凋亡，这些化合物已成为新的研究热点。
如体外试验中艰难梭菌毒素B可剂量依赖性地抑制细胞凋亡早期启动子鸟苷三磷酸酶、Rho和 Rac,减轻氨基甙类抗生素的耳毒性，这种毒素同时可降低c-Jun的磷酸化水平[8]。c-Jun的磷酸化是JNK信号通路中的调节点。JNK信号通路阻断剂CEP1347，同样可以减轻氨基甙类抗生素的耳毒性[17]。JNK磷酸化抑制剂D-JNKI-1可以几乎完全抑制新霉素诱导的外毛细胞的死亡，同时完全抑制新霉素诱导的c-Fos（一种与凋亡有关的核转录因子）的表达，体内试验观察到同样的结果[9]。
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(收稿日期：2008-10-28)
