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[摘要] 目的：探讨中药单体川芎嗪（TMP）对肝星状细胞（HSC）转化生长因子-β1（TGF-β1）信号传导的影响。通过检测TGF-β1及其Ⅰ型和Ⅱ型受体、Smad 3及Smad 7 mRNA表达的变化，探讨川芎嗪抗肝纤维化作用的相关机制。方法：体外培养人肝星状细胞， RT-PCR法检测HSC中TGF-β1及其Ⅰ型和Ⅱ型受体、Smad 3及Smad 7 mRNA表达。结果：与阴性对照组相比，TMP A、B、C各组均可显著降低TGF-β1 mRNA（P＜0.01）；TMP B、C组TβRⅠmRNA相对表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；TMP B、C浓度组的TβRⅡmRNA、Smad 3 mRNA表达量显著降低（P＜0.01）；TMP B、C组可显著升高Smad 7 mRNA表达量（P＜0.01）。结论：川芎嗪可降低HSC中TGF-β1及其Ⅰ、Ⅱ型受体及Smad 3 mRNA表达，同时促进Smad7 mRNA表达，表明川芎嗪可抑制肝星状细胞的活化、增殖，这可能与阻断TGF-β/Smad通路的信号传导有关。
[关键词] 川芎嗪；肝纤维化；转化生长因子-β1；TβRⅠ；TβRⅡ；Smad 3；Smad 7
[中图分类号] R969 [文献标识码]A[文章编号]1674-4721（2011）08（b）-０19－０3
Effects of tetramethylpyrazine on Transforming Growth Factor-β1 transduction of Human Hepatic Stellate Cells
FAN Yuhui1, ZHU Lin2, HUA Haiying3
1.Technician Training College of Medicine of Henan Province,Kaifeng 475003, China; 2.Department of Pharmacology, First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Henan Province, Kaifeng 475000, China; 3.Zhengzhou University Academy of Medical and Pharmaceutical Sciences,Henan Province, Kaifeng 475003, China
[Abstract] Objective: To investigate the effects of tetramethylpyrazine on Signal Transduction Induced by Transforming growth factor-β1 in Human Hepatic Stellate Cells. To explore the anti-hepatic fibrosis mechanisms of tetramethylpyrazine by studying the expressions of TGF-β1 mRNA, typeⅠ and typeⅡ TGF-β receptor mRNA, Smad 3 and Smad 7 mRNA. Methods: HSCs cultured in vitro were divided into negative control group, positive control group(cultured with Matrine 500 mg/L), experimental group(cultured with different concentrations of TMP (50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、800 mg/L). The effect of TMP was evaluated of the level of TGF-β1, TβRⅠ, TβRⅡ, Smad 3 and Smad 7 mRNA by RT-PCR. Results: Compared with the negative control group, all of TMP groups of TGF-β1 mRNA expression of significant difference (P 1.2 细胞
人肝星状细胞株Lx-2，购自上海坤肯生物化工有限公司。
1.3 试剂
Trizol，北京赛百盛基因技术有限公司。Oligo，上海捷瑞生物工程有限公司。RT-PCR试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养Lx-2细胞株为表型活化的HSC。采用含10% 小牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM培养液，常规培养于37℃、5% CO2培养箱中，每3~4天传代1次。
1.4.2 实验分组实验分为TMP组、阳性对照组、阴性对照组。其中TMP组包括A组50 mg/L、B组200 mg/L、C组800 mg/L 3个剂量组；阳性对照组选择苦参素作为阳性对照药物，用药剂量为500 mg/L；阴性对照组，加入等容量不含药物的培养液。
1.4.3 RT-PCR法检测TGF-β1及其Ⅰ型和Ⅱ型受体、Smad 3及Smad 7mRNA表达制备细胞爬片，分别加入各组药物后继续培养48 h。引物设计，根据Genebank中人TGF-β1及其Ⅰ型和Ⅱ型受体、Smad 3及Smad 7mRNA或cDNA基因序列，采用Primer Premier 5软件设计RT-PCR测定所需引物序列：GAPDH（212bp）A：5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′，S：5′-GAACGGATTTGGTCGTATTGGG- 3′；TGF-β1(321bp)A：5′-CTAAGGCGAAAGCCCTCAAT- 3′，S：5′-GCAGGAAACCCACAACGAA- 3′；TβRⅠ(287bp)A：5′-CCTCACGGAACCACGAAC- 3′，S：5′-CCGCACTGTCATTCACCA- 3′；TβRⅡ(387bp)A：5′-TGTCCCAGAGCACCAGAG- 3′，S：5′-ACGCCAAGGGCA ACTTAC- 3′； Smad 3(354bp)A：5′-GGCTGGCCGAATAGTGA-3′，S：5′-GGACAGTGGCTGGAAGAGT- 3′；Smad 7(358bp)A：5′-ATCGG GTATCTGGAGTAAGG- 3′，S：5′-ACTCGGTGCTCAAGAAACTG- 3′。Trizol抽提总RNA，方法按照试剂说明书操作，用紫外分光光度计测定RNA浓度，RNA浓度为1.8。逆转录扩增按试剂盒说明书操作，PCR循环参数为94℃ 2 min预变性，94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1 min循环30次，72℃延伸7 min，4℃保存。取10 μl RT-PCR产物，1.5%含0.5×TBE的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，用Quantity One软件进行光密度分析。
1.5 统计学处理
统计结果用SPSS 10.0软件包处理，所有数据以均数±标准差表示，组间差异用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法检验，统计前均对各组数据进行正态性检验和方差齐性检验，取α＝0.05为显著性检验水准。
2 结果
2.1 TMP对HSC中TGF-β1 mRNA表达的影响
与阴性对照组相比，TMP组、阳性对照组TGF-β1 mRNA相对表达量均差异有统计学意义（P＜0.01）；与阳性对照组相比，TMP 50 mg/L 、200 mg/L 浓度组差异无统计学意义（P＞0.05），TMP 800 mg/L 浓度组TGF-β1 mRNA相对表达量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）（表1）。
2.2 TMP对HSC中TβRⅠmRNA表达的影响
与阴性对照组相比， TMP 200 mg/L、800 mg/L组TβRⅠmRNA相对表达量降低，其差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；与阳性对照组相比，TMP 800 mg/L组TβRⅠmRNA表达量差异有统计学意义（P＜0.01）（表1）。
2.3 TMP对HSC中TβRⅡmRNA表达的影响
与阴性对照组相比，阳性对照组TβRⅡmRNA表达量显著降低（P＜0.01），TMP 200 mg/L、TMP 800 mg/L浓度组的TβRⅡmRNA相对表达量均差异有统计学意义（P＜0.01）；与阳性对照组相比，TMP 200 mg/L 浓度组差异无统计学意义（P＞0.05），TMP 200 mg/L 、800 mg/L 浓度组TβRⅡmRNA表达量差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）（表1）。
2.4 TMP对HSC中Smad 3 mRNA表达的影响
与阴性对照组相比，阳性对照组Smad 3 mRNA表达量显著降低（P＜0.05），TMP 200 mg/L、 800 mg/L浓度组的Smad 3 mRNA相对表达量均差异有统计学意义（P＜0.01）；与阳性对照组相比，TMP 800 mg/L浓度组Smad 3 mRNA表达量差异有统计学意义（P＜0.01）（表1）。
2.5 TMP对HSC中Smad 7 mRNA表达的影响
与阴性对照组相比，TMP 200 mg/L、800 mg/L组Smad 7 mRNA表达量显著升高，其差异有统计学意义（P＜0.01）；与阳性对照组相比，TMP 800 mg/L组Smad 7 mRNA表达量的差异具有统计学意义（P＜0.01）（表1）。
3 讨论
目前所公认的肝纤维化形成过程大致为，致肝损伤因子如病毒性肝炎、化学毒物质等造成肝细胞损伤坏死；激活枯否细胞（Kupffer Cells, KC），释放大量细胞因子和活性氧；继之肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells, HSC）被激活、转化为肌成纤维细胞（Myofibroblaster, MFB），MFB通过旁分泌、自分泌促进本身增生的同时，在细胞因子的进一步刺激下，合成和分泌大量的ECM，减少其降解，使ECM过度沉积，导致纤维组织增生、肝纤维化形成[5-6]。HSC在肝纤维化过程中发挥关键作用，HSC的激活是肝纤维化发生发展的中心环节[7-8]。
随着分子生物学技术的广泛应用，对肝纤维化的发生机制有了更深的研究。众多研究结果表明，细胞因子与肝纤维化之间也有着密切的关系，各种细胞因子通过自分泌和旁分泌彼此相互作用形成细胞因子网络，共同调控肝纤维化的发生和发展。TGF-β1是现已知最强的肝纤维化促进因子[9-10]。活性TGF-β1首先识别细胞膜表面的TβRⅡ，并与之结合，使TβRⅡ自身磷酸化，磷酸化后的TβRⅡ具有磷酸激酶活性，可被TβRⅠ(TGF-β type Ⅰ receptor, TβRⅠ)识别并结合，形成TβRⅡ-TGF-β1-TβRⅠ三聚体复合物，再通过TβRⅠGS区磷酸化而激活，激活后TβRⅠ也具有磷酸激酶活性[11]。而后主要通过激活Smad通路实现信号传导，转移至核内，通过直接与靶基因特定DNA结合或与其他DNA结合蛋白结合或与转录激活子（Co-activator）/共抑制子（Co-repressor）形成复合物共同发挥作用，刺激包括胶原基因在内的相关基因转录，产生ECM大量沉积等复杂生物学效应[12-13]。目前已知的Smad至少有8种，按其结构和功能的差异分为三种类型：第一类为受体激活型，包括Smad 1、2、3、5、8，其中Smad 2、3介导TGF-β的信号传导，第二类为共用型，包括Smad 4，通过与R-Smad结合参与TGF-β信号传导；第三类为抑制性Smads，包括Smad 6、7，可拮抗R-Smad介导的信号传导，形成控制TGF-β反应的负反馈环路[14-15]。Smad 7作为I-Smad可竞争性结合活化的TβRⅠ，使之无法磷酸化Smad 2、Smad 3，从而阻断TGF-β1信号传导[16-17]。
近年来中药通过对TGF-β/Smad信号通路的干预，防治肝纤维化日趋受到重视。川芎嗪可抑制肝纤维化大鼠的肝细胞凋亡，使肝组织TGF-β1显色指数降低，提示在川芎嗪的保肝作用中有阻断肝细胞凋亡的机制参与, 这可能与其抑制肝星状细胞（HSC）的激活, 减少TGF-β1的分泌有关[18]。但仍未见川芎嗪对TGF-β/Smad信号通路影响方面的详细报道。
本课题应用RT-PCR法，检测TMP对人肝星状细胞（Lx-2）中TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad 3、Smad 7mRNA表达的影响。结果显示，经TMP处理的TMP 50 mg/L～800 mg/L浓度均可显著降低TGF-β1 mRNA（P＜0.01）；TMP 200 mg/L、800 mg/L组TβRⅠmRNA相对表达量降低，其差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；TMP 200 mg/L、TMP 800 mg/L浓度组的TβRⅡmRNA 、Smad 3 mRNA表达量显著降低（P＜0.01）；TMP 200 mg/L、800 mg/L组可显著升高Smad 7 mRNA表达量（P＜0.01）。提示TMP可通过影响TGF-β1 及其信号通路发挥抗肝纤维化作用。
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（收稿日期：2011-04-27）
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