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【摘要】 目的用化疗药物建立免疫细胞抑制的动物模型，以免疫细胞为观察指标评价复方转移因子的提高免疫细胞的能力。方法 用环磷酰胺（CTX）灌胃（100 mg/kg）,隔天一次，连续五次，造成免疫功能抑制的动物模型，通过不同实验组用药前后免疫细胞的变化，以评价复方转移因子高、中、低（相当人用量的2、5、10 倍）剂量组是否能提高实验动物的免疫细胞。结果 复方转移因子能显著提高实验小鼠白细胞数量，复方转移因子低、中、高剂量组与模型组比较，P+T淋巴细胞的绝对数，P+T淋巴细胞的数量，并与剂量有关。�
【关键词】 复方转移因子；CD4+T淋巴细胞；环磷酰胺；动物模型��
Study on traditional medicine compound transfer factor provocate CD4+ T lymphocyte of experiment
LI Yu-hu,MIAO Zhu-lei,CHENG Guo-qiang,et al． Shanghai University of Traditional Chinese Medicine． Shanghai 201203,China�
【Abstract】 Objective Animal model of immunosuppression has been found by chemotherapeutics. Ability of traditional Chinese medicine compound transfer factor improve immunocyte, this result may be evaluated by immunocyte as a index.Methods Animal model of immunosuppression has been found by using cyclophosvnamide for intragastric administration, one time each other day, lavaging 5 times consecutively. Evaluated traditional Chinese medicine compound transfer factor high、medium、low dosage groups(equal to 2、5、10times of people using) improve or not immunocyte of experimental animals through changes of immunocyte before and after different experimental groups have been given to medicines. Result Traditional Chinese medicine compound transfer factor can increase remarkably amounts of WBC. Traditional Chinese medicine compound transfer factor high、medium、low dosage groups compare to model group ,P+ T lymphocyte of experimental mouses, P+ T lymphocyte of experimental mouses, concerned with its dosages. �
【Key words】Compound transfer factor;WBC/ CD4+ T lymphocyte; Cyclophosvnamide; Animal model
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HIV病毒是一种杀细胞性病毒，此病毒主要在CD4+T淋巴细胞内大量增殖并破坏细胞。而CD4+T淋巴细胞是人体中极其重要的免疫细胞，它的破坏，逐渐导致免疫功能衰竭。这样，即使对正常人来说是一个微不足道的感染，如小伤口或普通感冒,也可能致艾滋病患者于死地。因此，通常患者不是死于HIV感染本身,而是各种继发的机会性感染和肿瘤。�
关于HIV发病机理的研究近年来出现了一些新的观点,如“HIV病的肠道主要病灶论”认为肠免疫组织是最易感的解剖部位,在正常情况下,肠道免疫系统处于生理性活化状态和生理性低反应性状态,其生理性活化状态为HIV感染提供了大量的易感细胞。而在HIV感染时,由于危险信号的释放,调节性T细胞优先被删除等原因导致生理性低反应性状态被打破,而出现免疫过度活化,从而产生更多的易感细胞,通过直接感染以及活化诱导细胞凋亡,使肠道T细胞在短期内大量丢失,从而导致免疫缺陷.初步说明了“HIV病的肠道主要病灶论”的可能性[1-2]。本实验以此为依据，用环磷酰胺灌胃，造成实验动物肠道淋巴细胞（也包括血液淋巴细胞）大量下降的动物病变，可模拟HIV中、晚期的免疫状态（CD4+T淋巴细胞↓）。用体外对T淋巴细胞有增殖作用的中药复方来治疗，从而达到利用中药复方来干扰CD4+T淋巴细胞大量下降的病变而终止HIV病变的进程。这种方法可在普通实验室进行，成本低廉，可用于大样本初筛，安全无传染。如用HIV（SIV）病毒[3]，则费用高，传染性强。�
1 材料与方法�
1．1 实验材料�
1．1．1 动物 KM小鼠，100只，雌雄各半，体质量（18±1）g，清洁级动物，中科院上海实验动物中心提供，合格证：scxk(沪)2007-0005。�
1．1．2 实验室气象条件 温度22℃～25℃，湿度40%~70%。�
1．1．3 试剂与仪器�
1．1．3．1 试剂 环磷酰胺（CTX），江苏恒瑞医药股份有限公司生产，批号07041721。复方转移因子，本实验室制备。健康猪脾，用超滤仪超滤，得转移因子溶液（10mg/ml左右）[3-6]。中药紫花地丁、甘草等。煎煮二次，浓缩后加食用酒精提取。二者按一定的比例混合，得复方转移因子。复方转移因子制剂中的转移因子含量为4 mg/10 ml和中药生药含量为1 g/10 ml。�
1．1．3．2 仪器 全自动血液分析仪（型号 XE-2100）,流式细胞仪（型号 FACS Calibur）。�
1．2 造模方法与药物干预�
1．2．1 分组 100只KM小鼠随机均分为5组，每组20只，雌雄各半。灌胃体积1 ml/次，20 g。正常对照组（0．9%NaCl灌胃，环磷酰胺不灌胃）；模型组（0．9%NaCl灌胃，同时环磷酰胺灌胃）；复方转移因子低剂量组（药物相当人用量的2倍，同时环磷酰胺灌胃）；复方转移因子中剂量组（药物相当人用量的5倍，同时环磷酰胺灌胃）；复方转移因子高剂量组（药物相当人用量的10倍，同时环磷酰胺灌胃）。�
1．2．2 实验过程 上述各组按设计分别进行灌胃并称体质量，环磷酰胺灌胃分别于实验的第1天，第3天，第5天，第7天，第9天，环磷酰胺灌胃剂量为100 mg/kg,在第1、3、5、7、9天下午环磷酰胺灌胃，上午药物灌胃，第1～14天每天药物灌胃。第15天各组称体质量，采血，送实验室检测白细胞、淋巴细胞数、淋巴细胞百分比、CD4+T细胞等。�
1．2．3 观察项目 ①小鼠体重变化；②小鼠血液白细胞、淋巴细胞数、淋巴细胞百分比、CD4+T细胞等。�
1．3 统计学方法 实验数据以统计软件SPSS11．5 进行统计分析，用药组与模型对照组计量资料比较运用t检验。�
2 结果�
2．1 各组小鼠在实验第1天和第15天的体质量结果如下。�
2．2 各组小鼠在实验第15天眼眶取血1～2 ml,立即送检，全自动血液分析仪分析血液各项指标。�
注：正常对照组与模型组比较，��**� P+T淋巴细胞大量下降的动物病变，可模拟HIV中、晚期的免疫状态。用体外对T淋巴细胞有增殖作用的中药复方来治疗，从而达到利用中药复方来干扰CD4+T淋巴细胞大量下降的病变而终止HIV病变的进程[7-10]。基于上述理由，本研究提出如下工作假说：本课题通过中药复方的干预作用，以延长生存时间为目的。在艾滋病中、晚期主要是因为CD4+T大量下降，引起免疫缺损，而转移因子在体内外均可使CD4+T分裂增殖。CD4+T分裂增殖到达一定的数量就使艾滋病的病理进展中断，从而使带毒生存时间大大延长。第二，本制剂中的紫花地丁、野菊花、白头翁等，在体外实验中具有抑制SIV的作用。本制剂如果在体内能有效抑制HIV，则可阻止艾滋病的病理进展，提高艾滋病患者的带毒生存期。从这一工作假说出发，本课题在方法学上观察实验动物用药前后CD4+T细胞水平。以评价中药复方的药物效果。这为中药复方的临床应用提供依据。�
本次实验造模方法是灌胃，剂量为100 mg/kg,连续5次用环磷酰胺灌胃后，可造成典型的WBC和CD4+T细胞下降的动物模型[11-12]。 �
小鼠的体质量结果经统计学分析，正常对照组与模型组比较，P+、CD8+ T细胞百分比和CD4+、CD8+ T细胞的绝对数经统计学分析，结果见附表3。用药各组与模型组比较，P+、 CD8+ T细胞百分比和CD4+、CD8+ T细胞的绝对数均高于模型组。
用药组与正常对照组比较，P+T细胞百分比和CD4+、CD8+ T细胞的绝对数均低于正常对照组。说明造模成功。并且说明用药后并不能完全恢复。与复方转移因子低剂量组比较，P+、CD8+ T细胞的绝对数均高于低剂量组。说明复方转移因子提高淋巴细胞百分比和CD4+、CD8+ T细胞的绝对数并与剂量关系明显。�
本课题开展的中药复方干预艾滋病进程作用机制的研究,是利用现代生物技术提取转移因子,在国内外首次将转移因子加入到复方中药中。进行抗艾滋病治疗的研究。是现代生物技术与中医中药相结合的范例。 研究中药复方促进艾滋病患者CD4+ T细胞增殖及减缓艾滋病的临床进展可能存在的关系，尤其是CD4+T细胞与不同中医治法的相关性。本研究从转移因子能在体内外可使CD4+T细胞增殖和复方中药抑制HIV二方面,来探讨中药复方减缓艾滋病的临床进展的可行性,开辟了艾滋病临床治疗的新视角，有利于艾滋病临床治疗的进一步深化，并可能为艾滋病患者长期带毒生存提供理论基础。�
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