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[摘要] 目的 探讨外源性磷酸肌酸钠（CP）对缺血再灌注肢体的保护作用。 方法 健康成年家兔20只，随机分为对照组、缺血再灌注组（IR）、低浓度磷酸肌酸钠组（LCP)和高浓度磷酸肌酸钠组（HCP），每组5只。制备兔左后肢缺血再灌注模型。静脉注射生理盐水和不同浓度的CP，再灌注前、后不同时间取血测定血清乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙二醛(MDA)的含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力。电镜观察肌细胞超微结构变化。 结果 缺血再灌注后LCP和HCP组LDH、AST、MDA含量低于IR（P＜0.05），SOD活力显著高于IR（P＜0.01）；电镜下LCP和HCP组肌损伤轻于IR组。 结论 外源性磷酸肌酸钠能够保护缺血再灌注骨骼肌。
[关键词] 外源性磷酸肌酸钠；兔；骨骼肌；再灌注损伤
[中图分类号] R541 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2011）36-08-02
Protective Effects of Creatine Phosphate on Ischemia and Reperfusion Injury of Limbs
LIU Mingming1 DING Ming2
1.The Anesthesiology of Weifang Medical College，Weifang 261041， China； 2.The Anesthesia Department of the 89th Chinese People"s Liberation Army Hospital，Weifang 261023，China
[Abstract] Objective To study the protective effect of creatine phosphate on ischemia reperfusion of skeletal muscle. Methods The experimental models of ischemia referfusion injury in extremities were produced in 20 healthy adult rabbits,which were randomly divided into control，reperfusion,low concentration and high concentration with 5 rabbits in each .Isolated left hindlimb of rabbits were used as ischemia-reperfusion models.Normal saline injection, Creatine phosphate 0.5g and 1g were infused intravenously into the three groups just before blood reperfusion. At the points of pre-ischemia,1 and 4 hours after reperfusion,the blood samples were collected respectively for measurements of LDH,AST, MDA and SOD. Meanwhile,the tibialis anterior muscles were harvested for examination of the micro-structure and the ultrastructure by using electron microscope. Results After reperfusion,the contents of AST,LDH,MDA significantly decreased（P＜0.05）and the activity of SOD obviously increased in the HCP and LCP groups compared with reperfusion group（P＜0.01）. The electron microscope examinations showed severe tissue injury in the reperfusion group but mild in HCP and LCP groups. Conclusion Creatine phosphate has a significant protective effect on ischemia reperfusion injury in extremities.
[Key words] Creatine phosphate ；Rabbit； Skeletal muscle；Reperfusion injury
临床上常见的断肢(指)再植、软组织损伤、骨筋膜室综合征、血栓形成及应用止血带时间过长等,均会引起肢体缺血-再灌注（Ischemia-reperfusion， I-R）损伤[1]。磷酸肌酸钠作为一种外源性的能量合剂,对缺血再灌注心肌具有确切保护作用[2]。但外源性磷酸肌酸钠对骨骼肌缺血再灌注损伤的影响尚未见报道。本实验制备家兔肢体缺血再灌注损伤模型，探讨外源性磷酸肌酸钠对肢体缺血再灌注骨骼肌的作用。
1 材料与方法
1.1动物分组与模型建立
健康成年家兔20只，体重2.5～3.5kg，雌雄不限，解放军第89医院动物中心提供。随机分为对照组、IR、LCP和HCP，每组5只。
1.2 建立家兔后肢缺血再灌注损伤动物模型
3%戊巴比妥钠30mg/kg静脉麻醉，参照Crinnion[3]法建立家兔后肢骨骼肌缺血再灌注损伤模型。①对照组：只解剖出股动静脉，不阻断不环扎。②缺血组：恢复血流前耳缘静脉给予生理盐水1mL，再灌注4h。③低浓度组：恢复血流前给予外源性磷酸肌酸钠溶液（北京利祥制药有限公司生产，0.5mg，生产批号100602）0.5g/mL 1mL，再灌注4h。④高浓度组：恢复血流灌注前给予外源性磷酸肌酸钠1g/mL 1mL，再灌注4h。
1.3检测项目及方法
四组分别于缺血前、缺血再灌注1h、再灌注4h，3个时相点采血并制备电镜标本。
1.3.1生化指标检测 AST、LDH的测定采用罗氏P800全自动生化分析仪。MDA和SOD测定采用硫代巴比妥钠法和黄嘌呤氧化酶法，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，严格按照说明书操作。
1.3.2电镜观察 将取得的骨骼肌标本切成1mm×1mm×1mm大小的组织块，经30g/L戊二醛4℃前固定2h，再经锇酸后固定，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，铅铀双重染色，透射电镜观察并摄片。
1.4 统计学处理
所得数据以均数±标准差（χ±s）表示。应用SPSS13.0统计软件进行数据处理，多组样本均数间先进行方差齐性检验，不同组间同一时间比较采用单因素方差分析，当差异明显时进一步比较采用LSD检验，方差不齐则采用Dunnet’s T3法，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血清学检测结果
缺血组再灌注后1h、4h，IR组较对照组AST、LDH、MDA含量明显升高（P＜0.01），SOD的活力明显下降（P＜0.01）；缺血再灌注后1h和4h，HCP和LCP组AST、LDH、MDA含量较IR组降低（P＜0.05），SOD的活力明显增高（P＜0.01）。见表1。
2.2 电镜结果
再灌注后4h，IR组显示线粒体呈明显空泡样变，可见明显髓样变，线粒体嵴断裂、消失。LCP组仍可见相当正常结构肌组织,但线粒体部分呈空泡样变、髓样变，部分线粒体嵴断裂。HCP组肌组织基本完整，线粒体未见明显损伤变性。
3讨论
肢体缺血再灌注损伤指肢体缺血达到一定时间，在恢复血供后反而出现比缺血时更加严重的损伤，表现为组织结构与功能损害的进一步加重。缺血再灌注损伤是个多机制参与的损伤过程,能量代谢障碍、钙离子超载、氧自由基、白细胞介导的炎症反应等在骨骼肌缺血再灌注损伤中起关键作用[4]。
正常肌细胞内含丰富的AST、LDH，肌细胞受损后酶可释放入血，其含量高低可反映细胞损伤的程度。SOD可有效清除氧自由基，反映机体抗氧化能力； MDA是脂质过氧化作用的最终产物，其含量可间接反映氧自由基对机体造成的损伤程度。SOD和MDA是反映氧化损伤的指标[5]。
线粒体在缺血再灌注损伤发生及其发展中决定细胞存亡的关键[6]。CP可以抑制5’-核苷酸酶的活性，使溶血磷脂酸甘油脂浓度下降，稳定磷脂膜。CP维持呼吸链正常氧化磷脂化功能保证ATP高水平，使氧自由基生产减少，保护机体免受氧自由基损伤[7，8]。
本次实验显示，缺血再灌注后IR组AST、LDH、MDA含量较对照组明显升高（P＜0.05），SOD活力较对照组明显降低（P＜0.01），说明IR组骨骼肌在缺血再灌注后发生了脂质过氧化反应，细胞膜损伤严重。LCP组和HCP组缺血再灌注后AST、LDH、MDA含量较IR组降低（P＜0.05），SOD活力升高显著（P＜0.01）。经电镜形态学观察证实在缺血再灌注4h后IR组细胞损伤明显，LCP组细胞损伤较IR组减轻，HCP组几乎接近正常组织细胞。本实验说明应用外源性磷酸肌酸钠能减轻脂质过氧化反应，组织清除自由基能力增强，减轻线粒体的损伤，对肢体缺血再灌注损伤有显著的保护作用。本研究为外源性磷酸肌酸钠在肢体缺血再灌注损伤保护方面，提供了一定的实验依据，但最佳保护剂量还有待进一步探索。
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（收稿日期：2011-10-19）
