【www.zhangdahai.com--商业计划书】
[摘要] 目的：建立通脉丸中竹节香附素A及总皂苷含量测定方法。方法：采用HPLC法测定竹节香附素A的含量，色谱条件：AgilentSB-AQ色谱柱，乙腈与0.1%磷酸水为流动相梯度洗脱，流速0.8 ml/min，检测波长206 nm；采用比色法，以竹节香附素A为对照品，5%香草醛-冰乙酸-60%硫酸为显色剂，在531 nm处测定吸光度，计算总皂苷的含量。结果：液相法测定竹节香附素A对照品质量在0.573～3.820 μg（R2=0.999 6）范围内呈良好线性关系，平均加样回收率为99.63%（RSD=1.05%）；比色法测定竹节香附素A对照品质量在0.024 2～0.217 8 mg范围内与吸光度呈良好线性关系（R2=0.999 0），平均加样回收率为100.05%（RSD=1.69%）。结论：建立了通脉丸中竹节香附素A及总皂苷含量测定方法，此方法简便、准确、稳定，为其制剂的质量控制及新制剂的二次开发提供技术支持。
[关键词] 通脉丸；竹节香附素A；总皂苷；含量测定
[中图分类号] R286.0 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2012）01（a）-０05－０3
The determination of Raddeanin A and total saponins in Tongmai pill
CHEN Tianchao1, WANG Junjie2
1. Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine, Henan Province, Zhengzhou 450000, China; 2. Pharmaceutical College, Henan Collenge of Traditional Chinese Medicine, Henan Province, Zhengzhou 450008, China
[Abstract] Objective: To establish a method for the determination of Raddeanin A and total saponins in Tongmai pill. Methods: A HPLC determination of Raddeanin A, Chromatographic conditions: Agilent SB-AQ chromatographic column, Gradient elution by Acetonitrile and 0.1% phosphoric acid water as mobile phase,velocity 0.8 ml/min, wavelength was 206 nm; Colorimetric method used to Raddeanin A as reference, 5% vanillin-acetic acid-60% sulfuric acid as the color reagent, absorbance was measured at 531 nm to calculate the total saponin content. Results: Determination of liquid Reference standard of Raddeanin A quality was linear in the range of 0.573-3.820 μg (R2=0.999 6). The average recovery was 99.63％ (RSD=1.05％); Colorimetric method determination Raddeanin A quality was linear in the range of 0.024 2-0.217 8 mg (R2=0.999 6). The average recovery was 100.05％ (RSD =1.69％). Conclusion: Established Tongmai pill of Raddeanin A and total saponins method for the determination , this method is simple, accurate, stable, for quality control and preparation of the secondary development of new agents to provide technical support.
[Key words] Tongmai pill; Raddeanin A; Total saponins; Content determination
通脉丸是由附子、黄芪、两头尖、制马钱子、当归、赤芍、甘草等中药组成的纯中药制剂，是本院名老中医、全国周围血管专业主任委员崔公让教授的经验处方，已有30余年的使用历史。具祛风湿，通经络，消痛肿之功效。用于风寒湿痹，四肢痉挛，骨节疼痛，痈肿，动脉硬化闭塞症、血栓闭塞性脉管炎，大动脉炎等动脉缺血性疾病所致寒凝脉络型脱疽。现代研究表明，处方中主要含有皂苷类、黄酮类、多糖类等有效成分，其中，皂苷类成分是通脉丸发挥药理效应的主要成分之一，文献[1-3]表明：两头尖具有“祛风除湿，消痈肿”之功效；现代临床用于风寒湿痹，四肢拘挛，骨节疼痛，痈疽溃烂；其竹节香附素A等皂苷类成分是发挥药效的物质基础。笔者采用HPLC与比色法对竹节香附素A及总皂苷进行含量测定，对其制剂的质量控制及新制剂的开发具有重要意义。
1 仪器与试药
1.1 仪器
高效液相色谱系统Waters e2695、Waters 2998 PDA检测器（美国），TU-1800PC紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司），AEL-200电子天平（日本岛津），HH-S4型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司），KDM电子控温电热套（山东邺城新华仪器厂）。
1.2 试药
竹节香附素A对照品（批号：201008，纯度>98%，四川维克奇生物科技有限公司），实验中所用药材均购于河南中医学院第一附属医院中一公司，经鉴定均符合《中国药典》2010年版各品种项下规定，娃哈哈纯净水，甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯，其他均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 竹节香附素A含量测定
2.1.1 色谱条件 AgilentSB-AQ色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱程序：0～20 min（乙腈39%～44%），20～25 min（乙腈44%），25～29 min（乙腈44%～39%），29～39 min（乙腈39%），流速0.8 ml/min，柱温30℃，检测波长206 nm。
2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取竹节香附素A对照品1.91 mg，置10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成浓度为0.191 mg/ml对照品溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备 按通脉丸1/4处方量称取各味药材共计155.375 g，置圆底烧瓶中加7倍量70%乙醇溶液，加热回流3次，每次80 min，合并提取液，备用。
2.1.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例称取除两头尖外其余药材，按2.1.2供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。
2.1.5 阴性干扰试验 取上述对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液，分别注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录色谱图，供试品与对照品在相同保留时间处有色谱峰，阴性对照在此保留时间处无干扰峰（图1～3）。
2.1.6 线性关系考察 取对照品溶液3、5、10、15、20 μl，按上述的色谱条件，注入液相色谱仪，测得峰面积，以对照品进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=71 649X+13 696（R2=0.999 6），表明竹节香附素A在0.573～3.820 μg呈良好线性关系。
2.1.7 精密度试验 精密吸取竹节香附素A供试品溶液，重复进样6次，竹节香附素A峰面积的RSD为0.72%（n=6）, 表明仪器精密度良好。
2.1.8 稳定性试验 精密吸取通脉丸醇提供试品溶液，分别在0、1、2、4、8、12、24 h进行测定，记录色谱图，测得竹节香附素A含量RSD为1.26%，表明供试品溶液稳定性良好。
2.1.9 重复性试验 平行吸取6份同一批供试品溶液，按上述色谱条件连续测定6次，结果RSD为0.76%（n=6），表明此方法的重复性良好。
2.1.10 加样回收率试验 精密量取已知含量的样品9份，每份10 ml，分别精密加入不同体积竹节香附素A对照品溶液，混匀。按上述色谱条件测定竹节香附素A含量，计算回收率，结果见表1。
2.1.11 验证试验 按处方比例平行取三份样品按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算竹节香附素A含量，分别为0.074 8、0.073 9、0.072 0 mg/ml。
2.2 总皂苷含量测定
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取竹节香附素A对照品2.42 mg于10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成浓度为0.242 mg/ml的对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 按通脉丸1/4处方量称取各味药材共计155.375 g，置圆底烧瓶中加7倍量70%乙醇溶液，加热回流3次，每次80 min，合并提取液，放冰箱中备用。精密量取醇提液（室温）20 ml于蒸发皿中，水浴蒸干，用10 ml水溶解残渣，置分液漏斗中用水饱和正丁醇萃取3次，每次20 ml，合并正丁醇液置蒸发皿中蒸干，甲醇溶解残渣并转移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再精密量取甲醇定容液1 ml于25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
2.2.3 测定波长的选择 精密量取0.5 ml竹节香附素A对照品溶液与1 ml供试品溶液置具塞试管中，水浴蒸干，加入5%香草醛-冰乙酸（临用新配）0.5 ml，60%硫酸溶液3 ml，摇匀，60℃水浴显色20 min后取出立即冰水浴5 min，摇匀。立即在紫外-可见分光光度计于440～660 nm波长范围下扫描，同时以空白溶液作参比。对照品及供试品均在531 nm有特征吸收，故选531 nm为检测波长。吸收光谱见图4、5。
2.2.4 线性关系考察 精密量取竹节香附素A对照品溶液0.10、0.30、0.50、0.70、0.90 ml，置具塞试管中，水浴蒸干，加入5%香草醛-冰乙酸（临用新配）0.5 ml，60%硫酸溶液3 ml，摇匀，60℃水浴显色20 min后取出立即冰水浴5 min，摇匀。以同法平行处理的空白溶液为空白对照，在531 nm处测定吸光度。以对照品质量（mg）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=4.336 8X-0.000 8，（R2=0.999 0），在0.024 2～0.217 8 mg范围内线性关系良好。
2.2.5 精密度试验 精密量取供试品溶液0.5 ml于具塞试管中，依“2.2.4”项下显色方法在531 nm测定吸光度，连续测定6次，结果RSD为0.36%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.2.6 稳定性试验 精密量取供试品溶液0.5 ml于具塞试管中，依“2.2.4”项下方法显色，并分别在显色后0、5、10、15、20 min在531 nm处测定吸光度，结果RSD为0.43%，可见本测定方法在显色20 min内，吸光度值比较稳定，因此，测定最好在20 min内完成。
2.2.7 重复性试验 平行制备6份供试品溶液，依“2.2.4”项下显色方法在531 nm测定吸光度，连续测定6次，结果RSD为0.56%（n=6），表明此方法的重复性良好。
2.3 加样回收率试验
精密量取已知总皂苷含量供试品9份，每份0.5 ml，分别加入不同体积的竹节香附素A对照品溶液，混匀，依“2.2.4”项下显色方法在531 nm测定吸收度，计算回收率，结果如表2。
3 讨论
色谱方法及梯度条件选择：本法依据2010年版《中国药典》[2]中竹节香附素A含量测定方法，但药典中方法并不理想，更适合药材中竹节香附素A的含量测定；复方中成分复杂，干扰程度大，药典方法需改进。笔者考察了甲醇-水[4]、乙腈-冰醋酸溶液、乙腈-磷酸溶液等不同流动相及不同梯度条件，结果表明使用乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱分离效果最好，出峰时间适宜。
通脉丸醇提液中主要含有竹节香附素A、黄芪甲苷、甘草酸类等皂苷类成分，单一测定某一成分具有片面性，不能有效代表处方中发挥药理效应的化学成分，因此采用比色法测定复方中总皂苷，从整体上把握处方中有效成分。文献[5-7]供选择的显色剂有香草醛-高氯酸、浓硫酸-甲醇、茴香醛-高氯酸和香草醛-浓硫酸等测定总皂苷，经试验比较得出，采用5%香草醛-60%硫酸比色法测定通脉丸方中总皂苷含量，其方法精密度、重现性、稳定性、加样回收率均较好。其他显色剂显色后，供试品与对照品特征吸收不一致、吸光度在很短的时间内变化较大、空白对照溶液颜色深等因素，造成含量测定稳定性差，精密度低。
本文建立了通脉丸中HPLC法测竹节香附素A及比色法测总皂苷的含量测定方法，经方法学考察，线性、重复性、稳定性精密度均良好，阴性无干扰，通过此方法可控制其制剂质量，以保证制剂质量的稳定及临床疗效。
[参考文献]
[1] 中国医学科学院药物研究所.中药志[M].北京:人民卫生出版社,1981:357.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:157.
[3] 周鸿立,孙永旭,李勇,等.两头尖的化学成分及药理作用研究进展[J].时珍国医国药,2007,18(5):1239-1241.
[4] 高颖,刘大有,郭鹏.RP-HPLC法测定粉针剂中两头尖皂苷D的含量[J].武警医学院学报,2010,19(1):20-22.
[5] 赵启铎,王颖,舒乐新,等.消炎止咳浸膏中总皂苷的含量测定[J].天津中医药大学学报,2009,28(4):201-202.
[6] 高明森,于海春,王春颖.黄芪总皂苷含量测定的研究[J].实用中医内科杂志,2009,23(10):31.
[7] 薛磊,朱丹妮,严永清,等.生脉散制剂中总皂苷含量的测定[J].中成药,2004,26(11):897-900.
（收稿日期：2011-10-11）
