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【摘要】 目的 本研究旨在观察白色念珠菌细胞壁不溶性β-葡聚糖(Candida Albicans Insoluble β-Glucan, CAIBG)对体外培养的B16恶性黑色素瘤细胞、SGC-7901胃腺癌细胞、SMMC-7721 肝癌细胞的生长抑制作用。方法 自制CAIBG,采用改良MTT法检测CAIBG在不同时间和不同浓度对体外培养的以上几种肿瘤细胞的生长抑制作用。结果 CAIBG对B16恶性黑色素瘤细胞和SGC-7901胃腺癌细胞有体外生长抑制作用,生长抑制率最高分别为42.8%和59.88%,IC50分别约为1.51 mg/μl和0.43 mg/μl。CAIBG对SMMC-7721肝癌细胞的体外生长不具有直接抑制作用。结论 CAIBG具有体外直接抑制B16恶性黑色素瘤细胞和SGC-7901胃腺癌细胞生长的作用。CAIBG是具有良好的应用开发前景抗肿瘤药物。
【关键词】 白色念珠菌细胞壁不溶性β-葡聚糖;生长抑制;肿瘤细胞
Experimental Study of Effect of Candida Albicans Insoluble β-Glucan on the M alignant Tumor Cells in Vitro
TAO Jia,CUI Jin.Pathology department of affiliated hospital of North Sichuan Medical College,Nanchong,Sichuan 637000,China
【Abstract】 Objective In this study, we explored whether CAIBG could suppress the m alignant melanoma B16 cells, gastric carcinoma SCG-7902 cells, hepatoma SMMC cells growth in vitro. Methods Insoluble β-glucan was extracted from Candida albicans, and the reforming MTT assay was used to evaluate the growth inhibition effect of different concentrations of CAIBG on m alignant melanoma B16 cells, gastric carcinoma SCG-7902 cells, hepatoma SMMC cells at different times in vitro. Results CAIBG had inhibitory effects to the m alignant melanoma B16 cells, gastric carcinoma SCG-7902 cells in vitro, and the highest growth inhibitory rate of the m alignant melanoma and gastric carcinoma were 42.8% and 59.88%, and IC50 were about 1.5 μg/μl and 1.81 μg/μl respectively, but had no growth inhibition effect to hepatoma SMMC- 7721 cells. Conclusion CAIBG has growth inhibitory effect on m alignant melanoma B16 cells and gastric carcinoma SCG-7902 cells. CAIBG is wothy of further research and development.
【Key words】 CAIBG;Growth inhibition;Cancer cell
作者单位:637000川北医学院附属医院病理科(陶佳);昆明医学院重点实验室病理室(崔进)
恶性肿瘤是影响人类身心健康和引起人类疾病死亡的主要原因,目前治疗恶性肿瘤的方法有消化道反应、造血功能抑制等明显毒副作用,令患者痛苦,且治疗不彻底,复发率高,因此开发高效低毒的抗肿瘤药物具有必要性和重要性。白色念珠菌是一种条件致病性真菌[1],其细胞壁的结构似三明治-内层为葡聚糖(glucan),外层为甘露聚糖,其中葡聚糖和甘露糖蛋白至少占细胞壁干重的80%[2],β-葡聚糖是白色念珠菌细胞壁含量最高的多糖。
本研究前期实验已经成功地从白色念珠菌细胞壁中提取出碱溶性β-葡聚糖(CABBG)、酸溶性β-葡聚糖(CAABG),并分离出不溶性的β-葡聚糖[3](CAIBG),且急性毒性实验研究结果显示CAIBG比CAABG、CABBG的安全范围更大,最值得进一步研究其药效学作用。
本研究自制CAIBG,体外培养B16恶性黑色素瘤细胞、SGC-7901胃腺癌细胞和SMMC-7721肝癌细胞,观察并结合MTT法检测CAIBG对以上几种肿瘤细胞生长的抑制作用。
1 材料和方法
1.1 瘤细胞株 SGC-7901胃腺癌株、SMMC-7721肝癌株,由云南省天然药物药理重点实验室提供;B16恶性黑色素瘤株从中国科学院典型培养物保藏中心昆明细胞库处购买。
1.2 菌株 白色念珠菌-CJ(Candida albicans-CJ),云南省天然药物药理重点实验室保存菌株。
1.3 药品与主要试剂 噻唑蓝(MTT)为德州德药制药有限公司产品;a-淀粉酶为上海博奥生物技术有限公司产品;RPMI1640为GIBO公司产品;胎牛血清为杭州四季青生物公司产品。
1.4 主要仪器 发酵罐(NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC,型号BIOFLO-410); CO2培养箱(日本Olympus公司,型号BH2); 酶联免疫检测仪(美国BIO-RAD公司,型号680)。
1.5 白色念珠菌的培养 按方法[4]共收集3000 g白色念珠菌菌体。
1.6 CAIBG的提取 按方法[5]获得干燥粉末100 mg,放入4℃保存备用。
1.7 自制CAIBG剂型及给药浓度 用电子天平准确称取CAIBG粉末,溶于1%吐温-80溶液中,0.2 μm微孔滤膜过滤后,即配制成不同浓度的溶液。
1.8 采用改良MTT法检测CAIBG对癌细胞的体外抑制作用:常规培养B16恶性黑色素瘤细胞、SGC-7901胃腺癌细胞和SMMC-7721肝癌细胞至对数生长期后,用0.25%胰蛋白酶消化细胞,用含10%胎牛血清RPMI1640培养基调整细胞以1×10.4细胞/孔的密度分别接种于3个96孔板,每孔加细胞悬液90μl,每个浓度设5个复孔,在37℃,100%相对湿度,含5%CO2的培养箱预培养24 h。待细胞贴壁后,分别加入500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5 μg/ml、31.25 μg/ml的多糖溶液、阴性对照剂生理盐水和溶剂对照剂吐温80各10μl。分别置37℃、CO2培养箱培养24 h、48 h、72 h后,加入MTT(5 mg/mL) 10 μl继续培养,4 h后加入三联液100 μl,过夜,次晨在570 nm波长处用酶标仪测吸光度(A570)值。试验重复三次,计算各组均值。根据以下公式计算出癌细胞生长抑制率:
癌细胞生长抑制率%=(1-实验组平均A570值/对照组平均A570值)×100%
数据处理通常以T/C表示,T/C=100×OD值�处理组�/OD值�对照组�。通过回归计算,求出T/C=50%的药物浓度,即IC50值(半数抑制浓度)
1.9 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件进行多组间及组内差异χ.2检验,各组实验的结果用抑癌率表示。
2 结果
2.1 CAIBG作用后肿瘤细胞的形态学变化(见图1-图4),镜下观察:对照组细胞排列密集,细胞呈圆形,大小不一,核分裂相及瘤巨细胞多见。而加有CAIBG的B16恶性黑色素瘤细胞和SCG-7901胃癌细胞,排列稀疏,核分裂相减少,细胞呈多形性改变。CAIBG组和阴性对照组比较,SMMC-7721肝癌细胞形态没有明显变化。①B16恶性黑色素瘤细胞;②SCG-7901胃癌细胞。
图1 阴性对照组48 h
图2 CAIBG(500 μg/ml)48 h
图3 阴性对照组48 h
图4 CAIBG(31.25 μg/ml)48 h
2.2 CAIBG对体外培养B16恶性黑色素瘤细胞的生长抑制作用。
表1
CAIBG对体外培养B16恶性黑色素瘤细胞的�生长抑制作用
组别剂量抑瘤率%(24 h)抑瘤率%(48 h)
CAIBG500 μg/ml38.20*42.80.*
250 μg/ml36.20.*40.42.*
125 μg/ml32.60.*37.80.*
62.5 μg/ml27.30.*30.66.*
31.25 μg/ml24.50.*29.44.*
阴性对照组00
注:实验组与阴性对照组比较,.*P
