【www.zhangdahai.com--保证书】
摘 要目的：探讨不同时间阴道超声辅照，对人早孕胚胎绒毛细胞凋亡的影响，以期为临床阴道超声辅照时限提供新的佐证。方法：选择拟行人工流产的60例健康早孕妇女，分为对照组(未照射)、辐照3min、辐照5min和辐照10min组。应用探头频率5.0-MHz的阴道超声，对孕囊进行不同时间持续辐照。辐照后24小时行人工流产取绒毛。采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的原位末端标记法(TUNEL)行细胞凋亡的组织学检测，免疫组织化学方法(S-P法)检测促/抑凋亡基因Bax和Bcl-2蛋白在组织中的表达。结果：对照组早孕绒毛细胞有少量凋亡细胞存在，辐照组凋亡细胞数目增加；辐照3min组出现凋亡细胞数目增多与对照组比较无显著性差异(P >0.05)。随着照射时间延长凋亡细胞数目明显增加，与对照组及辐照3min组比较有明显差异 (P 0.05)，照射10min组Bax蛋白表达明显增强，与其他三组比较差异有显著性(P 0.05)。结论：阴道超声辐照后增加早孕绒毛细胞的凋亡，且随照射时间的延长，绒毛细胞的凋亡指数逐渐升高，以照射10min组的绒毛细胞凋亡指数最高。阴道超声辐照后早孕胚胎绒毛细胞滋养细胞及合体滋养细胞Bax蛋白表达增加，随着照射时间的延长Bax蛋白表达逐渐增加； Bcl-2蛋白表达减弱，与阴道超声辐照时间长短无关。孕早期的阴道超声辐照3分钟内是安全的，辐照5分钟相对安全，阴道超声的直接辐照最好不要超过10分钟。
关键词阴道超声；绒毛；凋亡
AbstractObjective：To investigate the effect of TVU on the apoptosis of chorionic villi cells in first-trimester pregnancy. Methods：60 healthy women in first-trimester pregnancy were randomly divided into 4 groups according to different exposure time: control group (bland radiation), 3min, 5min and 10min. Gestation sacs were radiated by TVU with 5.0-MHz transducer. The chorionic villi were collected 24 hours after exposure. The apoptosis of chorionic villi cells were analyzed by TUNEL. The expression of Bax and Bcl-2 proteins were analyzed by immunohistochemistry. Results：The apoptosis cells of chorionic villi were increased according to the time of exposure. In contrast with the control group and 3 min groups, the apoptosis cells were increased significantly in 5 minand 10 min groups (P 0.05). The expression the Bax in syncytiotrophoblast and cytotrophoblasts were increased significantly in 10 min group (P 0.05). Conclusions：The apoptosis of chorionic villi cells increased after the exposure to TVU, and the apoptosis index increased according to the time of exposure. The apoptosis index was highest in the 10min group, but there was no difference between control group and 3 min group. The expression of Bax protein in the cytotrophoblasts and syncytiotrophoblasts increased after the exposure to TVU, and it was accoding to the exposure time. The expression of Bcl-2 protein in the cytotrophoblasts decreased after the exposure to TVU, which was independent on the exposure time. In the early pregnancy stage, it is safe to expose the fetus to TUV within 3 minutes. And it is almost safe within 5 minutes. But the time expose to TUV should not longer than 10 minutes.
Key wordstransvaginal ultrasonography；chorionic villi； apoptosis
随着辅助生殖技术的开展，阴道超声广泛用于卵泡监测、取卵及多胎妊娠减胎术等过程中，且趋于早期化、多次化。阴道超声照射作为一种外源性的应激原对生殖细胞及胚胎潜在的生物效应及其安全性越来越受到重视，辐照后对子代组织或器官的发育分化的影响不应忽视。本研究探讨不同时间阴道超声辅照，对人早孕胚胎绒毛细胞凋亡的影响，以期为临床阴道超声辅照时限提供新的佐证。
1对象与方法
1.1对象
2007年7月～2007年12月我院妇科门诊计划外妊娠的早孕患者60例，平均年龄31.3±3岁，平均妊娠天数54.9±3.4天(月经周期和超声检查用于确定孕周)，孕囊平均直径2.3±0.8cm，均见胎芽和原始心管搏动。随机分成四组,对照组是没有接触阴道超声辐照的14例早孕妇女，辐照组为接受阴道超声辐照的46例早孕妇女，按照不同的辐照时间分为辐照3min组12例、辐照5min组18例和辐照10min组16例。
对辐照组的早孕妇女，超声显示孕囊后，以固定光束进行不同时间（3min、5min和10min）的持续辐照（探头频率为5.0MHz）。辐照射后24小时行人工流产，取绒毛组织置入0.9%生
理盐水中漂洗干净，将绒毛组织置于10%中性福尔马林溶液中固定，成批检测。
1.2方法
1.2.1标本的处理
经过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片并编号登记备用。
1.2.2TUNEL法检测细胞凋亡
试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司，专人操作。
结果判断：光镜下凋亡阳性细胞为核呈棕黄色，颗粒固缩，凝集于核膜下；细胞核呈月芽形斑块状、圆形或椭圆形。每张切片取10个高倍视野，计数每高倍视野凋亡细胞数，并计算凋亡指数(AI)。AI=阳性反应的滋养细胞核/观察的滋养细胞总和数×100%。
1.2.3S-P免疫组化检测Bax、Bcl-2
试剂盒购于福建迈新生物技术公司，专人操作。
结果判断：光镜下Bcl-2着色部位为胞浆或胞膜，Bax着色部位为胞浆。阳性细胞判断标准：不着色为阴性，评0分；淡黄色为弱阳性(+)，评1分；棕黄色为阳性(++)，评2分；深棕色为强阳性(+++)，评3分；每张切片选取10个高倍视野计数Bax 、Bcl-2阳性细胞，并计算阳性细胞率。阳性率=阳性细胞数/（阳性细胞+阴性细胞数）×100%。阳性率 50%为强表达。
1.2.4统计分析
所测数据以均数±标准差表示，用SPSS 10.0统计软件包进行处理。
2结果
2.1阴道超声辐照的不同时间对早孕胚胎绒毛细胞凋亡的影响
采用TUNEL法检测各组早孕胚胎绒毛细胞凋亡结果显示，对照组早孕绒毛有少量凋亡细胞存在，主要分布于合体滋养细胞，间质细胞分布很少，细胞滋养细胞没有凋亡细胞存在(见图1)。与对照组相比辐照组凋亡细胞增加，且随辐照时间延长，凋亡细胞数目逐渐增加（见图2、3、4）。
每张切片取10个高倍视野，计数凋亡细胞数目，并计算每组绒毛细胞凋亡指数发现，随阴道超声辐照时间延长，绒毛细胞凋亡指数逐渐升高，以辐照10min组绒毛细胞凋亡指数最高(P0.05)，见表1。
2.2阴道超声不同辐照时间对早孕胚胎绒毛细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响
免疫组化法检测各组绒毛细胞促凋亡Bax蛋白和抑凋亡Bcl-2蛋白表达结果显示，对照组促凋亡Bax少量分布于合体滋养细胞胞浆，细胞滋养细胞及间质含量极少(见图5)，辐照组细胞滋养细胞及合体滋养细胞Bax蛋白含量增加，且随辐照时间延长促凋亡Bax蛋白含量逐渐增加，大多呈阳性表达（见图6、7、8）。对照组抑制凋亡Bcl-2蛋白表达主要分布于细胞滋养细胞胞浆，合体滋养细胞中未见表达(见图9)，辐照组细胞滋养细胞Bcl-2蛋白表达减弱，多以中强度表达为主，与阴道超声辐照时间长短无关（见图10、11、12）。
每张切片取10个高倍视野，计数Bax、Bcl-2表达阳性细胞数目，并计算Bax、Bcl-2表达阳性率，发现随阴道超声辐照时间延长，Bax蛋白表达阳性细胞率逐渐增加，以辐照10min组的阳性率最高(P0.05）。与Bax蛋白表达不同，各组Bcl-2表达阳性率无显著性差异（P >0.05），见表2。
3讨论
阴道超声在辅助生殖技术中的应用日趋广泛。阴道超声辐照相对的安全时限，相关报道甚少。本课题从阴道超声对早孕胚胎辐照不同时间入手，观察辐照后早孕胚胎绒毛细胞凋亡程度及促/抑凋亡基因Bax和Bcl-2蛋白表达情况，从分子水平探讨临床阴道超声检查和治疗最安全的应用时间。
3.1 阴道超声辐照的不同时间对早孕胚胎绒毛细胞凋亡的影响
用TUNEL法检测早孕胚胎绒毛细胞凋亡发现，对照组也有少量凋亡细胞存在，主要分布于合体滋养细胞，间质细胞分布很少，细胞滋养细胞无凋亡细胞存在，证实了Chan〔1〕等报道早孕胚胎绒毛细胞中存在一定程度的细胞凋亡。与对照组相比辐照组凋亡细胞增加，且随着辐照时间延长，凋亡细胞数目逐渐增加，辐照3min、 5min、10min组凋亡指数逐渐升高，以辐照10min组凋亡指数最高(P0.05)。与杜联芳[2]报道用TUNEL技术检测腹部超声辐照10分钟绒毛细胞凋亡增加比较，阴道超声辐照早孕胚胎引起绒毛细胞凋亡增加的时间缩短，可能是与腹部超声辐照过程中腹部脂肪对超声波的衰减作用有关。与霍丽蓉[3]等用流式细胞技术发现经腹超声照射孕囊5min凋亡率显著增大比较，引起早孕胚胎绒毛细胞凋亡的时间相同，分析原因可能是与TUNEL技术比较流式细胞技术对细胞凋亡的检测更敏感。从细胞凋亡的角度分析，阴道超声辐照早孕胚胎的时间在3分钟以内是绝对安全的。随着辐照时间的延长绒毛细胞凋亡率增加，即存在时间依赖性。因早孕绒毛与胚胎组织同源, 绒毛受损一定程度上反映了胚胎发育受影响情况。因此，在临床工作中对人早孕孕囊阴道超声辐照应持谨慎态度，要避免定点长时间辐照，尽量将辐照时间控制在3分钟内。
3.2阴道超声辐照不同时间对早孕胚胎绒毛细胞Bax和Bcl-2表达的影响
Bcl-2和Bax作为一对重要的细胞凋亡调节基因，共同参与调节生理性或病理性的细胞凋亡过程〔4〕。用免疫组化法检测对照组促凋亡Bax蛋白少量分布于合体滋养细胞胞浆，细胞滋养细胞及间质含量极少；抑制凋亡Bcl-2蛋白主要分布于细胞滋养细胞胞浆，合体滋养细胞未见表达。同以往研究报道相符合〔5〕，早孕绒毛细胞存在凋亡是对增殖活跃的滋养细胞的适当限制，对绒毛过度入侵蜕膜是必要的，因而是一种正常的生理现象。我们的研究发现辐照组细胞滋养细胞及合体滋养细胞Bax蛋白表达增加，且随阴道超声照射时间延长Bax蛋白表达逐渐增加，辐照组细胞滋养细胞Bcl-2蛋白表达减弱，与辐照时间长短无关。通过计数Bax、Bcl-2蛋白表达阳性的细胞数目，并计算出各组Bax、Bcl-2蛋白表达的阳性率发现，随阴道超声辐照时间的延长，Bax蛋白表达阳性率逐渐增加，以辐照10min组Bax蛋白表达的阳性率最高 (P0.05），推测Bcl-2抑凋亡蛋白的功能发挥可能取决于其对抗性蛋白Bax的相互作用，即Bcl-2/Bax的表达平衡决定着绒毛细胞的命运。本研究结果表明虽然Bcl-2蛋白的表达在各辐照组中无明显差异，但由于各辐照组间Bax蛋白表达明显增强，导致Bcl-2/Bax的表达量失衡，两者的平衡关系被打破，最终诱发Bax介导的细胞凋亡增加。
综上所述，阴道超声辐照促进了早孕胚胎绒毛细胞的凋亡的进程，但是，阴道超声在何种剂量阈值或时间阈值将导致绒毛过度凋亡，进而影响胚胎的发育，有待深入研究。
参考文献
[1]Chan CC、 Lao TT、 Cheung AN. Apoptotic and proliferative activities in first trimester placentae. Placena, 1999, 20(2-3):223-227.
[2]杜联芳、张青萍、刘望彭. 超声诊断剂量与人早孕绒毛细胞凋亡. 中国医学影像学杂志, 2001,9(4):282-284.
[3]霍丽蓉、刘晋敏、杨宪增. 诊断级超声诱导早孕绒毛细胞凋亡. 中国超声医学杂志,2001,17(12):888-891.
[4]Williams GT、 Sabourin JC、 et al. Molecular regulation of apoptosis: genetic controls on cell death.Cell, 1993, 74:774-777.
[5]高洁、孙月玲、余志英等.自然流产绒毛及蜕膜细胞凋亡的基因调控研究.热带医学杂志,2007,7(5):442-444.
[6]韩昌、林杨、郑莹.凋亡基因表达与FGR胎盘细胞凋亡的相关性研究.中国妇幼保健.2005,20(19):2534-2536.
[7]Barnets B、Terhaarg R、 Ziskinm C、 et al. International Teconnendations and Guidelines for Ghe Safe Use of Diagnostic Ultrasound in Medicine. Ultra-sound Med Biol, 2000, 26(3):355-366.
附图：
阴道超声照射孕囊后胚胎绒毛组织细胞凋亡及相关基因表达
图1 正常早孕绒毛凋亡细胞的分布。TUNEL ×400
图2 阴道超声照射3min后早孕绒毛凋亡细胞的分布。TUNEL ×200
图3 阴道超声照射5min后早孕绒毛凋亡细胞的分布。TUNEL ×400
图4 阴道超声照射10min后早孕绒毛凋亡细胞的分布。TUNEL ×400
图5 bax在正常早孕绒毛组织中的表达。免疫组化S-P ×400
图6 bax在阴道超声照射3min后早孕绒毛中的表达。免疫组化S-P ×400
图7 bax在阴道超声照射5min后早孕绒毛中的表达。免疫组化S-P ×400
图8 bax在阴道超声照射10min后早孕绒毛中的表达。免疫组化S-P ×400
图9 bcl-2在正常早孕绒毛组织中的表达。免疫组化S-P ×400
图10bcl-2在阴道超声照射3min后早孕绒毛中的表达。免疫组化S-P ×400
图11bcl-2在阴道超声照射5min后早孕绒毛中的表达。免疫组化S-P ×400
图12bcl-2在阴道超声照射10min后早孕绒毛中的表达。免疫组化S-P ×400
