【www.zhangdahai.com--保证书】
【摘要】本实验主要研究暹罗鳄鱼鳞酶解物对小鼠免疫力的影响。采用10、20、40mg/kg bw给小鼠经口灌胃 30d，分别进行小鼠抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）、血清溶血素的测定（血凝法）、碳廓清实验。结果发现：鳄鱼鳞酶解物各剂量组的抗体生成细胞数量明显高于阴性对照组，高剂量组与对照组有显著的差异（分别为P＜0.05）；酶解物各剂量组的抗体积数均高于对照组，高剂量有显著差异（P＜0.05）；中、高剂量组均能增强小鼠碳廓清能力，高剂量组与对照组相比有显著性差异（P＜0.05）。结论：暹罗鳄鱼鳞酶解物能提高小鼠免疫力。
【关键词】暹罗鳄；鱼鳞；酶解物；免疫力
【中国分类号】R267【文献标识码】A【文章编号】1044-5511（2011）11-0125-01
随着鳄鱼人工养殖的成功，其价值得到多方面的开发，包括旅游观赏、餐饮、时装皮具等等。鳄鱼皮主要用于制作高档皮具，鱼鳞却成了工业垃圾。如何提取、利用鱼鳞的胶原蛋白将会成为水产综合开发的新突破。胶原蛋白的生物活性主要体现在提高免疫活性、降血压、调血脂、抗氧化、活化细胞机能和抑制肿瘤活性等方面［1］。津田友香等从鱼皮中得到水解胶原三肽，并证明具有促进人皮肤成纤维细胞胶原和透明质酸的生成、改善皮肤弹性的作用［2］。Koyama等发现胶原蛋白多肽能提高皮肤真皮和表皮的功能［3］。在美国、德国、日本等国家，许多高档化妆品中添加有胶原蛋白。美国CTFA 化妆品原料手册录用的天然物质和《功能性化妆品原料》中，都有胶原蛋白或其水解产物［4～5］。
文献报道中多为各种鱼鳞胶原蛋白的免疫增强作用，未见鳄鱼鳞胶原蛋白的相关研究。因此，本实验以小鼠为研究对象，探讨暹罗鳄鱼鳞胶原蛋白多肽对正常小鼠免疫功能的影响，为产品开发提供依据。
1 材料和方法［6］
1.1 材料与试剂:暹罗鳄鱼鳞酶解物：鳄鱼皮购自大丰实业（三亚）有限公司养殖场，酶解物自制。
1.2制法：用热水烫鳄鱼皮，使鱼鳞自皮上脱落，得到鱼鳞，鱼鳞剪成小块，加0.05mol/L－1 NaOH 溶液(W：V＝l：6)浸泡1 h，水洗至中性。再加0.2％硫酸溶液(W：V＝l：6)浸泡1h，洗至中性，最后用热水抽提过夜，4000 r/min－1离心20min，弃去沉淀不溶物，得到粗胶制品，浓缩后，45℃低温蒸干。称取制备的胶原蛋白，用缓冲液(pH9.0，0.02 mol/L －1)100 mI 溶解制成l％的胶原溶液。以酶与底物比为l：20的比例加中性蛋白酶，在45℃水浴中水解5h后，沸水浴中灭活酶15min，4000 r/min－1离心l5 min。取上清液，即为鳄鱼鳞胶原蛋白酶解液，－20℃保存备用。
清洁级 BALB/C 小鼠，雄性，18～22g，购自北京大学实验动物研究中心。脱毛剂、绵羊红细胞（SRBC）、Hank’s 液(pH7.2～7.4)、生理盐水、琼脂糖、SA缓冲液、印度墨汁、Na2CO3等。
1.3 仪器与设备:电子天平、微量血凝试验板、离心机、5%CO2培养箱、200目筛网、载玻片、保温箱、721 型分光光度计等。
1.4 动物实验分组与剂量设定:小鼠，18～22g，随机分为4个组，每组12只，分别为鳄鱼鳞酶解物10、20、40mg/kg组和阴性对照组，灌胃30d，阴性对照给予体积为0.2ml/10g生理盐水。
1.5 动物实验检测(1)抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）: 取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心10min（2000r/min），用生理盐水将压积SRBC配成2%（v/v）的细胞悬液，每鼠腹腔注射0.2ml。将免疫后5天的小鼠处死，取脾脏置盛有Hank’s液的平皿内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心10min（2000r/min），用Hank’s液洗涤2遍，最后将细胞悬液浮在8mL Hank’s液中。将表层培养基（1g琼脂糖加双蒸水至100mL）加热溶解后，放45~50℃水浴保温，与等量Ph7.2~7.4、2倍浓度的Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加入50μL10%SRBC（v/v，用SA缓冲液配制）、25μL脾细胞悬液，迅速混匀后倾倒于已刷琼脂糖层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片平扣在玻片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1.5h，用SA缓冲液稀释的补体（1:8）加入玻片架凹槽内，继续孵育1.5h，计数溶血空斑数。用空斑数/全脾细胞表示抗体生成细胞数。(2)血清溶血素的测定（血凝法）：取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心10min（2000r/min），用生理盐水将压积SRBC配成2%（v/v）的细胞悬液，每鼠腹腔注射0.2ml。将免疫5天后，摘除小鼠的眼球，取血于离心管内，放置约1h，2000r/min离心10min，分离、收集血清。用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝板内，每孔100μL，再加入100μL 0.5%（v/v）的SRBC悬液，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。按下式计算抗体积数： 抗体积数=（S1+2S2+3S3……nSn） 。 式中1、2、3…….n为对倍稀释的指数，S为凝集程度的级别。(3) 碳廓清实验:实验末期，小鼠称重后，按体重从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁(100ml/kg)，注入墨汁后2min(t1)、10min(t2)，分别从内眦静脉丛取血20μL，并立即将其加到2ml 0.1% Na2CO3 溶液中。用分光光度计在600nm处测光密度值(OD)，以 Na2CO3 溶液做空白对照，分别用OD1 和OD2 来表示 2min 和 10min 所取血样的光密度。将小鼠处死，解剖动物，取出肝脏、脾脏及胸腺，用滤纸吸干血迹后称重。
1.3 统计学方法:测定结果数据均用x±s 表示，用SPSSl6.0软件对结果进行t检验统计学处理，P＜0.05为差异有显著性意义。
2 结果
2.1 鳄鱼鳞酶解物对小鼠抗体生成细胞的影响:结果显示，经灌胃给予鳄鱼鳞酶解物30d，各剂量组的抗体生成细胞数明显高于对照组，高剂量组与对照组有显著性差异（P＜0.05）。表明，鳄鱼鳞酶解物有促进小鼠抗体生成细胞增殖的作用。见表1
2.3鳄鱼鳞酶解物对小鼠血清溶血素的影响:结果显示，经灌胃鳄鱼鳞酶解物30d，各剂量组的抗体生成细胞数明显高于对照组，高剂量组与对照组有显著性差异（P＜0.05）。表明，鳄鱼鳞酶解物有提高小鼠血清溶血素的作用。见表2
2.4 鳄鱼鳞酶解物对小鼠碳粒廓清的影响:结果可知：鳄鱼血冻干粉中、高剂量组能增强小鼠碳粒廓清能力，且高剂量组与对照组有显著性差异（P＜0.05）。表明，鳄鱼鳞酶解物能增强小鼠碳廓清的能力。见表3
3 讨论
目前，对于人工养殖暹罗鳄鱼产品的综合利用开发还处于空白阶段，本文首次对鳄鱼鳞采用酶解法得到胶原蛋白，为人工养殖鲟鱼副产品的后续研究提供参考。
本研究表明，小鼠抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）、血清溶血素的测定（血凝法）、碳廓清实验中，鳄鱼鳞酶解物各剂量组的抗体生成细胞数量明显高于阴性对照组，高剂量组与对照组有显著的差异（分别为P＜0.05）；抗体积数均高于对照组，高剂量有显著差异（P＜0.05）；中、高剂量组均能增强小鼠碳廓清能力，高剂量组与对照组相比有显著性差异（P＜0.05）。由此可知，暹罗鳄鱼鳞酶解物是可以开发成为增强免疫力的保健食品的。
参考文献
［1］郭瑶,曾名勇,崔文萱.水产胶原蛋白及胶原多肽的研究进展［J］.水产科学, 2006 25(2): 101-102.
［2］贺玉琢.水解胶原在皮肤的应用［J］.国外医学中医中药分册2005, 27(4): 246-248.
［3］Koyama Y, Sakashita A, Kuwaba K, et al. Effects of oral ingestionof collagen peptide on the skin ［J］. Fragrance Journal, 2006, 34(6):82-85.
［4］张铭让．林炜．皮胶原蛋在化妆品与蛋白饮料中的应用［J］．北京皮革，2000，(10) 42．
［5］裘炳毅．化妆品化学与工艺技术大全［M］．北京：中国轻工业出版社，1997：197．
［6］徐叔云, 卞如濂, 陈修 药理实验方法学 第三版 人民卫生出版社 2002
