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【摘要】 目的 观察高糖环境下豚鼠膀胱Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal，ICCs)内钙离子荧光及其超微结构的改变，探讨糖尿病膀胱(DCP)的发病机制。方法 采用原代培养, 激光共聚焦、透射电镜观察5、10、15 mmol/L葡萄糖浓度培养24、72 h的ICCs，扫描记录胞内荧光强度值，观察其超微结构。结果 糖浓度增高培养时间延长，ICCs内钙离子荧光值升高，胞内线粒体大小不等、数量减少、空泡样变甚至溶解，胞质广泛溶解，突起消失。结论 高糖环境对豚鼠膀胱ICCs电生理学、超微结构造成显著影响，这种改变可能是造成DCP发病的重要原因之一。�
【关键词】
Cajal间质细胞；高糖环境；钙离子；糖尿病膀胱；超微结构
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The changes of high glucose on ICCs
FAN Yong�hong. Department of Urology, The First People�s Hospital of Pingdingshan,Henan 467000,China
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【Abstract】 Objective
To observe a high glucose environment in guinea pig bladder of interstitial cells of Cajal (interstitial cells of Cajal, ICCs) Ca2+ fluorescence changes of diabetic bladder (diabetic, cystopathy, DCP) in the pathogenesis and ultrastructural. Methods Primary culture ICCs bladder cells observe ICCs at different concentrations(5,10,15 mol/L) and different times(24,72 h), by confocal laser scanning technology and transmission electron microscope, get the calcium fluorescence titer and their ultrastructural of ICCs. Results With the of increased glucose concentration, the duration of culture, ICCs Ca2+ fluorescence values increased. Their mitochondrion were inequality of size, abated of quantity, cavity affected and even dissolution. Cytoplasm were deliquesced generally,scabrosity vanished.Conclusion High glucose environment on guinea pig bladder ICCs electrophysiology and ultrastructural have a significant impact, such alterations may be one of the important reasons causing the onset of DCP.�
【Key words】
Cajal interstitial cells; High glucose environment; Calcium ion;Diabetic bladder;Ultrastructural
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作为膀胱慢波活动的起搏器和传导者，ICCs在去除其调控和影响因素的干扰后，仍然可以发生自发性兴奋和收缩[1，2]。因此推测：ICCs生功能的改变可能是DCP发病原因之一。而离体的Cajal间质细胞在高糖环境下变化的研究尚未见报道。本研究通过单细胞培养方法来观察高糖环境对 ICCs细胞内钙信号及其超微结构的影响，以探索DCP发病的细胞生物学机制。�
1 材料及方法�
1.1 材料与试剂
健康豚鼠。激光共聚焦显微镜，透射电镜，钙离子荧光剂Fluo�4 AM。�
1.2 方法�
1.2.1 单细胞培养豚鼠膀胱ICCs细胞
脱臼处死取膀胱，取肌层并剪成碎块，胶原酶V消化后DMEM接种于培养皿，普通培养箱中培养24 h后换以含葡萄糖5、10、15 mmol/L的细胞培养液继续分别培养24 h、72 h。刮取ICCs细胞离心，戊二醛固定细胞团。�
1.2.2 共聚焦显微镜观察
取Fluo�4AM原液制成5 μmol/L的工作液。共聚焦培养皿中ICCs加入工作液孵育，洗去胞外荧光剂再加DMEM培养液，室温避光恢复细胞活性。共聚焦显微镜下，油镜头、400倍、1.3NA，激光共聚焦寻找扫描记录ICCs内钙离子荧光值，每浓度/时间随机选20个ICCs样细胞。�
1.2.3 电镜观察
细胞团经冲洗、固定、梯度序列丙酮浸泡脱水、聚合，醋酸铀、柠檬酸铅顺序染色后切片，透射电镜下观察ICCs细胞。�
1.3 统计学方法
数据用表示，采用SPSS 16.0软件进行t检验和方差检验。P0.05)；而10 mmol/L组和15 mmol/L组荧光值均有明显差异(P 3 讨论�
糖尿病造成多系统病变。其最常见症状是DCP。DCP存在神经退化，突触和神经递质改变、逼尿肌肌细胞[3]病变、多种因子、受体分布和含量异常[4]等，但仍不能合理解答DCP的发病机理。�
ICCs作为膀胱慢波活动的起搏器和传导者，为研究DCP发病机理提供了新思路。本研究用单细胞培养法观察膀胱ICCs生理及超微结构在不同浓度糖环境中变化。结果:生理范围内的糖浓度不对ICCs内钙信号荧光值及其超微结构产生影响，而高浓度糖中ICCs内钙信号荧光值明显增高，超微结构破坏明显，且随培养时间延长、浓度增高其变化更显著。�
数据及图片分析：生理范围内糖浓度对ICCs并无明显影响。而10 mmol/L组钙信号荧光明显增强，电镜下核仁多，边集，细胞器如核糖体、内质网数量减少，胞突变短，较多颗粒状类释放物。培养72 h后前述特点加重，细胞器更少，颗粒状类释放物更多，位于胞突，有外释放之势，胞突特别多。推测高浓度糖刺激ICCs，其超微结构改变，使其生理功能代偿而增加，发生生理功能增强。过高的浓度(15 mmol/L组)24 h钙信号荧光值下降，其超微结构破坏更重，细胞分散，不成片，颗粒状类释放物较多，细胞器也明显减少，胞突几近于消失。72 h后荧光值又增高，但明显低于10 mmol/L72 h组，镜下见细胞破坏最重，线粒体数目极少，明显大小不一，部分细胞局部呈现坏死灶，胞突完全消失。推测可能是浓度过高的葡萄糖短时间对ICCs的生理功能产生抑制作用，但细胞功能随时间增长而恢复并代偿，致其信号增强，过浓的葡萄糖持续作用，破坏细胞越微结构，终使线粒坏死溶解，核糖体脱离内质网，胞质溶解，造成ICCs细胞生理功能逐渐下降。�
结果显示，葡萄糖环境影响ICCs功能及其结构，糖浓度高及影响时间长，其结构、功能变化就更明显。由此推测：高浓度糖破坏ICCs内超微结构，使其起搏和传递中介的功能、结构变化，膀胱兴奋能力改变，导致膀胱逼尿肌舒缩能力变化，而使DCP临床症状发生。ICCs超微结构被破坏，有可能是DCP发病的机制之一。�
参 考 文 献�
［1］ Jiang HH, SongB, Lu GS, et al. Loss of ryanodine receptor calcium release channel expression associated with overactive urinary bladder smooth muscle contractions in adetrusor instability model. BJU Int,2005,96 (3):428�433.�
［2］ McCloskey KD. Characterization of outward currents in interstitial cells from the guinea pig bladder.J Urol,2005,173(1):296�301.�
［3］ Mumtaz FH, Shukla N, Sullivan ME, et al.Inhibition of diabetic bladder smooth muscle cell proliferation by endothelin receptor antagonists. Urol Res,2000,28(4):254�259.�
［4］ Asano T, Saito Y, KawakamiM, et al, Clinical Pharmacology Study Group. Erythrocytic sorbitol contents in diabetic patients correlate with blood aldose reductase protein contents and plasma glucose level, and are normalized by the potent aldose reductase inhibitor fidarestat(SNK�860).Diabetes Comp lications,2004,18(6):336�342.
