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【摘要】 目的 建立高效液相色谱法测定独活寄生丸中蛇床子素的含量。方法 采用Hypersil ODSC18�(4.6 mm×200 mm,5 μm)色谱柱,甲醇-水(68:32)为流动相,流速为1.0 ml/min,检测波长322 nm。 结果 蛇床子素在0.0279~0.2511μg范围内呈良好的线性关系,r=0.999 9,平均回收率为100.19%(n=6),RSD=1.23%。结论 所建立的方法稳定、可靠,可为该产品建立质量控制方法提供参考。
【关键词】高效液相色谱法;独活寄生丸;蛇床子素;含量测定
HPLC determination of osthole in Duhuojisheng pills
CAO Xia-fei,ZHOU Lin.HengyangCenter forDisease Control,Hengyang 421001,China
【Abstract】 Objective To establish a HPLC method for determination of osthole in Duhuojisheng pills.Methods A Hypersil ODSC18� column(4.6 mm×200 mm,5 μm)was used with a mobile phase of methanol-water(30:70),the flow rate was 1.0 ml/min,detection wavelength at 322nm.Results The linearity range was0.0279-0.2511 μg(r=0.999 9),average recovery rate was 100.19%(n=6),RSD=1.23%.Conclusion This method is accurate and reproducible,and availed for quality control the Duhuojisheng pills.
【Key words】 HPLC;Duhuojisheng pills;Osthole;Determination
独活寄生丸由独活、桑寄生、当归、熟地黄、党参等组成,具有养血舒筋,祛风除湿的功效,用于风寒湿痹,腰膝冷痛等。该药品标准收载于《卫生部药品标准中药成方制剂第二册》,缺含量测定项。方中独活为君药,有祛风除湿,通痹止痛的功效,其主要有效成份为蛇床子素[1],本文采用高效液相色谱法对独活的蛇床子素进行了含量测定研究。该方法稳定、可靠,可为该产品建立质量控制方法提供参考。
1 仪器与试药
岛津LC-10AD高效液相色谱仪(配有SPD-10A检测器,N2000色谱工作站),AE240电子分析天平(梅特勒公司)。蛇床子素对照品(供含量测定用,批号:110822-200406,中国药品生物制品检定所提供),3批独活寄生丸(批号分别为:20060419,20060516,20060523)。甲醇为色谱纯,水为超纯化水,其他试剂均为分析纯。
2 溶液的制备
对照品溶液精密称取蛇床子素对照品13.95 mg,置100 ml量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,精密吸取1 ml,置10 ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
供试品溶液取本品适量,剪碎,取约3 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50 ml,密塞,称定重量,超声处理(功率250 W,频率45 KHz)40 min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液即得。
缺独活阴性样品溶液取缺独活阴性样品,同“2.2”项下方法操作,即得。
3 方法与结果
3.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为Hypersil ODSC18�(4.6 mm×200 mm,5 μm),流动相为甲醇-水(68:32),流速为1.0 ml/min,柱温为25℃。分别精密吸取“2”项下对照品溶液、供试品溶液及缺独活阴性样品溶液各10 μl,注入液相色谱仪,按本色谱条件测定。结果蛇床子素理论塔板数为11000以上,蛇床子素与邻近的杂质峰分离度为2.3以上,阴性样品在蛇床子素对照品相同保留时间位置上未见色谱峰,说明方中其他成分对蛇床子素测定无干扰,结果见图1。
A.对照品
B.样品
C.阴性样品
图1 HPLC色谱图
3.2 线性关系考察 精密吸取“2.1” 项下对照品溶液(0.013 95 mg/ml),分别吸取续滤液2、6、10、14、18 μl注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定峰面积,并以峰面积(Y)对进样量(X,μg)进行线性回归,得线性方程:Y=113 279 640X+8513.67 ,r=0.999 9,进样量在0.027 9~0.251 1 μg范围内呈良好的线性关系。
作者单位:421001湖南省衡阳市疾病预防控制中心(曹霞斐);
永州市药品检验所(周琳)
3.3 精密度、重复性试验和稳定性试验 按上述色谱条件,精密吸取“2.1” 项下对照品溶液连续进样6次,每次10 μl,峰面积平均值为18 028 286.5,RSD为0.86%,结果表明精密度良好。按“2.2” 项下方法处理同一批样品(批号:20060419)6份,HPLC分析,进样量均为10 μl,含量的平均值为0.233 9 m g/g,RSD为1.8%,结果表明重复性良好。精密吸取“2.2” 项下供试品溶液10 μl,按上述色谱条件于0、2、4、8、24 h进样测定,峰面积平均值为17 989 353.8,RSD为1.5%结果表明供试品溶液在室温下,24 h内稳定。
3.4 加样回收试验 取已知含量的独活寄生丸样品(批号:20060516,含量为0.231 6 mg/g)6份,每份约1.5 g,分别置具塞锥形瓶中,分别精密加入对照品溶液(0.034 89 mg/ml)各10 ml,再按“2.2” 项下方法制备供试品溶液,HPLC分析,进样量均为10 μl,结果见表1。
3.5 样品的测定 精密称取3批样品(批号分别为:20060419,20060516,20060523)各3份,每份约3 g。按“2.2” 项下方法制备供试品溶液,HPLC分析,进样量均为10 μl,按外标法计算蛇床子素含量,结果见表2。
表1
加样回收率测定结果(n=6)
编号样品含有量(mg)加入量(mg)测得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)
10.346 90.348 90.694 399.57
20.350 20.348 90.700 6100.43
30.346 20.348 90.699 4101.23100.191.23
40.348 70.348 90.695 099.25
50.351 20.348 90.695 698.71
60.343 60.348 90.699 3101.95
表2
样品测定结果(n=3)
批号含量(mg/g)RSD(%)
200604190.232 71.16
200605160.234 50.92
200605230.230 71.29
4 讨论
4.1 流动相的选择 参考文献[1],试验中考察了二组流动相系统:甲醇-水、乙腈-水,结果表明以甲醇-水(68:32)为流动相时,蛇床子素峰基线分离,且峰形较好,故选择流动相为甲醇-水(68:32)。
4.2 提取方法的选择[2] 比较超声提取与回流提取,发现蛇床子素提取率相差不大,因超声提取供试品溶液所含杂质较少,且方法简单,便于操作,故选择超声提取。曾试验了甲醇和稀乙醇提取,结果甲醇优。考察了甲醇溶剂量(25、50、75 ml),结果选择甲醇50 ml。考察了提取时间(20、40、60 min),结果选择40 min 。
参 考 文 献
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典.化学工业出版社,2005:185-186.
