梨黑斑病菌对苯醚甲环唑的敏感性分析

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摘要：采用菌丝生长速率法测定了苯醚甲环唑对分离自金水梨园的43个梨黑斑病菌[Alternaria alternata（Fries）Keissler]菌株的EC50。结果表明，苯醚甲环唑对梨黑斑病菌菌株的EC50分布在0.071 9～1.488 6 μg/mL范围内，平均值为0.507 2±0.333 3 μg/mL。W检验梨黑斑病菌对苯醚甲环唑敏感性的频次分布呈正偏态分布。菌株主体表现为敏感，但存在敏感性降低的菌株。

关键词：梨黑斑病菌[Alternaria alternata（Fries）Keissler]；苯醚甲环唑；敏感性

中图分类号：S432.4+4；TQ445.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）24-6448-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.031

梨黑斑病是砂梨生产中危害严重的病害之一。病原菌为链格孢真菌[Alternaria alternata（Fries）Keissler][1]。化学杀菌剂是防治梨黑斑病的主要手段。其中苯醚甲环唑是近年来常用的杀菌剂。目前尚无梨黑斑病菌对苯醚甲环唑存在抗药性的报道，但由于苯醚甲环唑作用位点单一，长期连续使用易使病原菌产生抗性，存在潜在的抗药风险。因而被杀菌剂抗性行动委员会划为中等抗性风险的药剂[2]。已有智利苹果黑星病菌（Venturia inaequalis）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearm）对苯醚甲环唑出现了抗性[3，4]。本研究旨在检测金水地区砂梨黑斑病菌对该杀菌剂的敏感性，为梨黑斑病菌的抗药性检测及制定合理的化学防控策略提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：编号JS-1～JS-43，为2016年从湖北省武汉市江夏区金水闸梨园采集，利用组织分离法分离得到，经柯赫氏法则及分子生物学技术鉴定，均为梨黑斑病菌。

供试药剂：10%世高（苯醚甲环唑）水分散粒剂（先正达作物保护有限公司），市购。

含药PDA培养基：将药剂溶于无菌水中，配成10 mg/mL的母液。以无菌水稀释成适当的浓度梯度，取10%体积的药液量加入到50 ℃左右的PDA培养基中，混匀，配制成终浓度为12.5、10.0、5.0、1.0、0.1 μg/mL的含药培养基，以无药剂的PDA培养基作对照。

1.2 敏感性测定

参考Yin等[5]的方法进行，将黑斑病菌在PDA培养基上培养3 d，获得菌落，用直径为5 mm的打孔器从菌落边缘生长旺盛处打孔，制备菌丝块。将菌丝块接种至含上述系列浓度药剂的PDA平板中央。置于26 ℃培養箱培养，16 h/8 h的光照/黑暗交替培养。以菌丝块接种至无药剂PDA平板作对照。每个处理设3个重复。

1.3 数据统计与分析

采用十字交叉法垂直测量菌落直径，减去菌丝块直径，即为菌落生长直径，求出各处理的平均直径，计算不同浓度梯度的菌丝生长抑制率。

抑制率=（1-）×100%

根据生物统计机率值换算表将菌丝生长抑制率换算成机率值。然后以杀菌剂浓度的对数值为横轴，以抑制率机率值为纵轴，得出LP-D线性方程y=ax+b，根据线性公式计算苯醚甲环唑对梨黑斑病菌各菌株的EC50（抑制中浓度）及r值（相关系数）。以SPSS软件对EC50进行正态分布检验，当P>0.05，则认为符合正态分布，反之，则为非正态分布。

2 结果与分析

2.1 苯醚甲环唑对不同梨黑斑病菌菌株的EC50测定结果

由表1可知，苯醚甲环唑对梨黑斑病菌的EC50分布在0.071 9～1.488 6 μg/mL范围内，平均值为0.507 2 μg/mL。菌株JS-2和菌株JS-23的EC50较高，分别为1.488 6、1.451 4 μg/mL。菌株JS-40、JS-43的EC50比较低，分别为0.071 9、0.106 1 μg/mL。最高值为最低值的20.70倍。

2.2 梨黑斑病菌敏感性分析

以SPSS检验正态性，由表2可知，W=0.863，P=0.000﹤0.05，说明各菌株对苯醚甲环唑敏感性的频次分布不符合正态分布。偏度系数SK=1.462>0，分布呈正偏态分布，峰度系数ku大于0（图1），表明金水地区黑斑病菌对苯醚甲环唑主体表现为敏感，但也出现了敏感性下降的菌株。

由于目前尚未见该病菌对杀菌剂敏感基线的报道，所以本研究以最小EC50为标准，计算供试菌株的抗性系数。抗性系数=待测菌株EC50/相对敏感菌株EC50。抗性系数1～3为敏感菌株，3～7为低抗菌株，7～10为中抗菌株，大于10的为高抗菌株。

3 小结与讨论

为明确金水地区梨黑斑病菌对苯醚甲环唑的敏感性，本研究采用菌丝生长速率法测定了苯醚甲环唑对金水梨园43个黑斑病菌菌株的EC50。W检验结果显示，黑斑病菌对苯醚甲环唑敏感性的频次分布呈正偏态分布。说明金水地区黑斑病菌株主体对苯醚甲环唑表现为敏感，但存在敏感性降低的菌株，可为梨黑斑病菌的抗药性检测及制定合理的化学防控策略提供理论依据。

但本研究仅测定了苯醚甲环唑对菌丝生长的EC50，还未开展对病原菌分生孢子的EC50的测定，而黑斑病菌的分生孢子在病害循环中是非常关键的一环[6，7]。黑斑病菌分生孢子对苯醚甲环唑的敏感性还需进一步的分析。此外，还应对该地区梨黑斑病菌的抗药性进行跟踪，以确定发展动态，从而判断是否产生严重抗药性，进而及早采取有效措施，防止抗药性发展。

参考文献：

[1] TERAKAMI S，MORIYA S，ADACHI Y，et al. Fine mapping of the gene for susceptibility to black spot disease in Japanese pear（Pyrus pyrifolia Nakai）[J].Breeding Science，2016，66：271-280.

[2] 刘长令.世界农药大全·杀虫剂卷[M].北京：化学工业出版社，2006.10-168.

[3] HENR？魱QUEZ S J L，SAEMIENTO V O，ALAC？魷N C P. Sensitivity of Venturia inaequalis Chilean isolates to difenoconazole，fenarimol，mancozeb and pyrimethanil[J].Chilean Journal of Agricultural Research，2011，71（1）：39-44.

[4] RCKANOVI E，MIHAJLOVI M，POTO NIK. In vitro sensitivity of Fusarium graminearum（Schwabe） to difenoconazole， prothioconazole and thiophanate-methyl[J].Pesticide Phytome- dicine，2010，25（4）：325-333.

[5] YIN Y N，LIU X，LI B Q，et al. Characterization of sterol demethylation inhibitor-resistant isolates of Fusarium asiatcum and F. graminearum collected from wheat in China[J].Phytophathology，2009，99（5）：487-497.

[6] 王贵元，崔文宁.梨黑斑病的生物学特性及其致病性研究进展[J].现代农业，2011（10）：16-18.

[7] 李永才，毕 阳.苹果梨黑斑病的发生及侵染过程[J].植物保护学报，2006，33（2）：131-135.

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