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郭 谊，韩 炎，周丽芝，王俊华，马 跃，鲁大鹏
(1.唐山市中医医院口腔科，河北 唐山063000；
2.文安县医院口腔科，河北 廊坊 065800；
3.唐山市第八医院口腔科，河北 唐山 063000；
4.文安县医院心内科，河北 廊坊 065800；
5.首都医科大学附属北京口腔医院急诊综合治疗中心，北京 100050)
口腔鳞癌是临床常见的口腔颌面部恶性肿瘤，具有发病隐匿、恶性程度高、易复发转移等特点，严重威胁患者生命健康[1]。手术切除、放化疗及联合治疗均是治疗口腔鳞癌的常用方法，但患者预后仍较差，5年生存率不足40%[2]。因此，了解口腔鳞癌发生发展的潜在机制，找到相关的治疗靶点非常重要。PIWI家族在各种生物中的表达具有广泛保守性，主要参与调控干细胞自我更新、转座子沉默、基因重组等过程[3]。精原干细胞自我更新基因PIWIL2是PIWI家族的重要成员之一，可介导转座子活化调控生殖干细胞的自我更新[4]。有研究显示，PIWIL2可能具有促进肿瘤发生的潜力[5]。Wang等[6]发现，PIWIL2可预测口腔鳞癌患者的预后及癌前口腔白斑的癌变风险，但PIWIL2在口腔鳞癌中的分子机制尚未完全明确。故本研究探讨PIWIL2对口腔鳞癌细胞CAL27增殖、侵袭、迁移和裸鼠皮下移植瘤生长的影响，旨在为新型抗肿瘤药物的开发和该病的治疗提供依据。
1.1 材料
细胞与动物：人口腔鳞癌细胞株CAL27(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)；
16只BALB/c雄性裸鼠，4～6周龄，体质量18～22 g，由河北省实验动物中心提供[动物生产许可证号：SCXK(冀)2018-004]，饲养于温度22～25 ℃、相对湿度40%～60%，每12 h光暗交替的环境中。
主要试剂：PIWIL2-shRNA慢病毒1#、2#和3#，慢病毒阴性对照病毒scramble(上海吉玛制药技术有限公司)；
胎牛血清、RPMI-1640培养基(美国Gibco)；
TRIzol试剂、逆转录试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(日本TaKaRa)；
Transwell小室、基质胶(美国BD)；
JC-1探针、细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)，兔抗Ki67、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、E-cadherin、N-cadherin、Snail抗体，小鼠抗β-actin抗体(美国Abcam)。
仪器：SpectraMax型多功能酶标仪(美国Molecular Devices)，CX21BIM-SET5型显微镜(日本OLYMPUS)，CyFlow Space型流式细胞仪(德国Partec)。
1.2 细胞培养及分组
用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基复苏CAL27细胞，取对数生长期细胞接种于24孔板，将细胞分为空白组(不作处理)，阴性对照组(转染慢病毒阴性对照病毒scramble)和PIWIL2-shRNA慢病毒1#、2#、3#组(转染PIWIL2-shRNA慢病毒1#、2#、3#)，其中慢病毒阴性对照病毒滴度为3×108TU/mL，以感染复数为50进行转染，培养72 h后加入1.5 mg/L嘌呤霉素，收集稳定低表达PIWIL2的细胞。
1.3 实时荧光定量PCR检测PIWIL2 mRNA表达
收集各组转染后细胞，加入TRIzol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA链，再添加SYBR Green PCR Master Mix试剂进行实时荧光定量PCR扩增。反应条件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，共38个循环。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算PIWIL2 mRNA的表达水平。PIWIL2上游引物序列为5’-ATCTATATCTGGCTGCTCCTC-3’，下游引物序列为5’-GATGCAAGATGTGTCCTGAC-3’；
GAPDH上游引物序列为5’-AGATCCACAACGGATACATT-3’，下游引物序列为5’-TCCCTCAAGAATGTCAGCAA-3’。
1.4 蛋白印迹法检测相关蛋白表达
收集各组转染后细胞，加入细胞裂解液提取总蛋白，定量后取70 μg进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白后切割目的蛋白处凝胶并转移至聚偏二氟乙烯膜上，加入封闭液室温封闭2 h，加入兔抗Ki67、VEGF、E-cadherin、N-cadherin、Snail抗体，小鼠抗β-actin抗体(1∶1 000)，4 ℃下反应过夜。洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000)，37 ℃下反应1 h，洗膜后进行暗室曝光显影。以β-actin为内参，目的蛋白条带灰度值与β-actin蛋白条带灰度值比值表示目的蛋白相对表达水平。
1.5 集落形成实验检测细胞增殖能力
收集各组转染后细胞，以500个/孔的密度接种于6孔板，培养约2周，每3天更换1次培养基，0.5%结晶紫染色后于光镜下计数集落细胞。
1.6 Transwell实验检测细胞侵袭能力
预先用基质胶包被Transwell小室上室，收集各组转染后细胞，用无血清培养基调整细胞密度为1×105/mL，接种100 μL细胞于小室上室，下室中加入含20%胎牛血清的培养基，培养24 h后取出小室，除去上室未侵入细胞，并将侵入细胞于甲醇溶液中固定，0.5%结晶紫染色后于光镜下计数染色侵袭细胞。
1.7 划痕实验检测细胞迁移能力
收集各组转染后细胞，以1×106/mL的密度接种于6孔板，当细胞贴壁后，用200 μL无菌微量移液管尖端垂直于板底中央划线，继续培养24 h。分别于0 h、24 h时光镜下选择划痕区拍照，测量划痕宽度，计算划痕愈合率。
1.8 JC-1探针检测线粒体膜电位
收集各组转染后细胞，以1×104/mL的密度接种于专用培养皿内，培养24 h后，添加500 μL JC-1工作液，继续培养20 min，流式细胞仪检测细胞内荧光情况。
1.9 沉默PIWIL2对口腔鳞癌生长的影响
将16只BALB/c裸鼠随机分为阴性对照组和PIWIL2-shRNA慢病毒组，每组8只。取对数期细胞，调整细胞浓度为5×109/L，接种于PIWIL2-shRNA慢病毒组裸鼠背部皮下，每只200 μL，构建裸鼠皮下移植瘤模型。每隔5 d测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积。肿瘤体积=长径×短径2/2。于第30天处死裸鼠，剥离肿瘤组织，称重并计算其体积。再将肿瘤组织于4%多聚甲醛中固定，制备石蜡组织切片，免疫组化染色检测肿瘤组织中VEGF的阳性表达。
1.10 统计学方法
2.1 PIWIL2-shRNA慢病毒转染下调细胞中PIWIL2表达
实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测结果显示，与阴性对照组比较，PIWIL2-shRNA慢病毒1#、2#和3#组CAL27细胞中PIWIL2 mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，以PIWIL2-shRNA慢病毒3#组降低最为显著(图1)，因此，后续选择PIWIL2-shRNA慢病毒3#沉默CAL27细胞中PIWIL2的表达。
a：PIWIL2 mRNA水平比较；
b：PIWIL2蛋白表达水平比较 *：与阴性对照组比较，P<0.05
2.2 沉默PIWIL2抑制CAL27细胞增殖能力
集落形成实验结果显示，与阴性对照组比较，PIWIL2-shRNA慢病毒组细胞集落形成率显著降低(P<0.05)，见图2。
a：集落形成实验光镜图(×200)；
b：集落形成率定量图 *：与阴性对照组比较，P<0.05
2.3 沉默PIWIL2抑制CAL27细胞中Ki67和VEGF蛋白表达
蛋白印迹法结果显示，与阴性对照组比较，PIWIL2-shRNA慢病毒组Ki67和VEGF蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，见图3。
a：Ki67和VEGF蛋白电泳图；
b：Ki67和VEGF蛋白表达定量图*：与阴性对照组比较，P<0.05
2.4 沉默PIWIL2抑制CAL27细胞侵袭能力
Transwell实验结果显示，与阴性对照组比较，PIWIL2-shRNA慢病毒组侵袭细胞数显著减少(P<0.05)，见图4。
a：Transwell实验光镜图(×400)；
b：侵袭细胞数定量图 *：与阴性对照组比较，P<0.05
2.5 沉默PIWIL2抑制CAL27细胞迁移能力
划痕实验结果显示，与阴性对照组比较，PIWIL2-shRNA慢病毒组划痕愈合率显著降低(P<0.05)，见图5。
a：划痕实验光镜图(×40)；
b：划痕愈合率 *：与阴性对照组比较，P<0.05
2.6 沉默PIWIL2降低CAL27细胞线粒体膜电位
JC-1探针结果显示，与阴性对照组比较，PIWIL2-shRNA慢病毒组红色荧光减少，绿色荧光增多，见图6。
a：JC-1探针检测流式图；
b：细胞中红绿荧光比较
2.7 沉默PIWIL2对CAL27细胞中相关蛋白表达的影响
蛋白印迹法结果显示，与阴性对照组比较，PIWIL2-shRNA慢病毒组E-cadherin蛋白表达水平显著升高，N-cadherin和Snail蛋白表达水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图7。
a：蛋白电泳图；
b：蛋白相对表达定量图 *：与阴性对照组比较，P<0.05
2.8 沉默PIWIL2抑制CAL27细胞裸鼠皮下移植瘤的生长
CAL27细胞裸鼠皮下移植瘤模型和免疫组化染色结果显示，与阴性对照组比较，PIWIL2-shRNA慢病毒组移植瘤重量较轻，肿瘤体积较小，移植瘤组织中VEGF阳性表达率显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图8。
a：移植瘤剥离观察图；
b：移植瘤重量比较；
c：移植瘤体积生长曲线；
d：移植瘤组织免疫组化染色(×200)；
e:移植瘤组织中VEGF阳性表达 *：与阴性对照组比较，P<0.05
早期研究认为，PIWIL2仅表达于生殖细胞，随着研究的不断深入，有学者发现PIWIL2在人类各种肿瘤中广泛表达，随后其在肿瘤领域的研究迅速发展[7]。Feng等[8]研究显示，PIWIL2可激活Wnt3a/β-catenin信号通路介导体细胞的重编程过程，使其获得干细胞特性，从而促进宫颈癌变。Zhao等[9]首次发现PIWIL2可通过调节细胞自噬和凋亡促进食管鳞状细胞癌的生长，且其高表达与患者的不良预后密切相关。有研究表明，PIWIL2在口腔鳞癌和恶变前口腔白斑中高表达，在口腔癌样干细胞中具有重建肿瘤异质性的能力[6]。本研究转染PIWIL2-shRNA慢病毒至CAL27细胞中下调PIWIL2表达后，细胞的增殖、侵袭、迁移能力明显降低，且CAL27细胞裸鼠皮下移植瘤的重量和体积也受到明显抑制，表明沉默PIWIL2可抑制CAL27细胞的增殖、侵袭及迁移。
细胞增殖抗原蛋白Ki67是一种仅存在于增生细胞的核蛋白，可表达于除G0期以外所有细胞周期阶段的细胞核增殖标志物，细胞周期为G1期时Ki67开始表达，在S期和G2期其表达逐渐升高，于M期达到峰值，但在有丝分裂结束后迅速分解[10]。因此，常以Ki67表达水平反映细胞增殖能力。VEGF是重要的血管生成因子，对血管的调控具有高度特异性和高效性，主要通过增加血管通透性和诱导血管形成促进肿瘤生长和转移[11]。本研究中PIWIL2-shRNA慢病毒组CAL27细胞中Ki67和VEGF蛋白表达水平降低，且移植瘤组织中VEGF阳性表达率也降低，说明沉默PIWIL2表达可抑制口腔鳞癌细胞的增殖。Qiu等[12]也发现，沉默PIWIL2后，肿瘤细胞增殖能力降低，细胞周期受到阻滞。此外，本研究还发现，沉默PIWIL2表达后，细胞线粒体膜电位下降，这是细胞凋亡过程中的标志性事件。
上皮间质转化是指在胞外信号的刺激下，上皮细胞丧失极性，获得间质细胞特性，从而具有浸润、游走、迁移的能力，这在肿瘤的侵袭和转移过程中具有重要作用[13]。上皮间质转化过程中伴有上皮细胞标志物(E-cadherin、β-catenin等)表达下调，间质细胞标志物(N-cadherin、波形蛋白等)表达上调，诱导上皮间质转化的细胞因子和转录因子(Snail、肿瘤生长因子β等)表达上调，辅助性诱导上皮间质转化的Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达上调[14-15]。Zhang等[16]通过构建PIWIL2诱导肿瘤干细胞衍生的外泌体发现，外泌体可促进成纤维细胞的癌症相关表型，增强细胞的增殖、迁移和侵袭能力。本研究结果显示，PIWIL2-shRNA慢病毒组CAL27细胞中E-cadherin蛋白表达水平高于阴性对照组，N-cadherin和Snail蛋白表达水平低于阴性对照组，提示沉默PIWIL2表达可抑制CAL27细胞上皮间质转化，从而抑制细胞侵袭及迁移。
综上所述，沉默PIWIL2可抑制口腔鳞癌细胞CAL27增殖、侵袭、迁移及裸鼠皮下移植瘤的生长，提示PIWIL2可能是口腔鳞癌的有效治疗靶点。
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