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章胜权，王煦程，叶福生，袁文华
(1.杭州市富阳中医骨伤医院，浙江 杭州 311400；
2.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053；
3.浙江萧山医院，浙江 杭州 311200；
4.浙江省中医院，浙江 杭州 310006)
绝经后女性人群中骨质疏松症的发生率较高，并且很多绝经后女性有明显的骨量减少[1]，而绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)导致的骨质疏松性骨折会给患者和家庭造成严重负担。骨质疏松症与中医学中的“骨痿”最为相似[2]。中医学理论认为，该病是由肾精亏虚、骨骼失养、脉络不畅、瘀血阻络所致，治疗当以补肾填精活血为主。依据上述病机和治则，临床常选用补肾活血方治疗该病[3]。补肾活血方的药物组成复杂，目前该方治疗PMOP的作用机制尚不完全明确。研究表明，骨质疏松症和脂代谢之间的关系密切[4-5]。为此，我们进行了此次实验，拟从脂代谢角度探讨补肾活血方治疗PMOP的作用机制，现总结报告如下。
1.1 实验动物9周龄SPF级健康雌性C57BL/6J小鼠15只，体质量18～20 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2013-0016。实验方案通过浙江中医药大学动物实验伦理委员会批准。
1.2 主要试剂补肾活血方药物组成包括熟地黄9 g、杜仲4 g、炮附片6 g、枸杞子9 g、山萸肉6 g、红花3 g、山药6 g、肉桂6 g、桃仁6 g、炙甘草3 g，所有药物均购自浙江中医药大学中药饮片有限公司，委托浙江省中医院制剂中心提取浓缩；
熟地黄、杜仲、炮附片、枸杞子、山萸肉、红花、山药、炙甘草以12倍量纯净水回流提取3次，肉桂、桃仁以10倍量60%乙醇浸泡提取3次，将水提物、醇提物充分混合后，浓缩至每毫升含生药3 g，小鼠用药量按体表面积折算为等效剂量。4%组织细胞固定液、柠檬酸钠缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)，苏木素、硫酸铝铵、碘酸钠、甘油、阿利新蓝(美国Sigma公司)，PBS磷酸盐缓冲液(北京博奥森生物技术有限公司)。
1.3 主要设备VIP 5jr脱水机(日本樱花公司)，AP280-2包埋机、HM355S石蜡切片机(德国Microm公司)，Zeiss Axio ScopeA1显微镜及显微拍摄系统(德国蔡司公司)，Skyscan117 Micro-CT(比利时布鲁克林公司)。
2.1 动物分组及造模将15只小鼠随机分为假手术组、模型组和补肾活血方组，每组5只，适应性喂养1周后进行造模。按0.009 mg·g-1给小鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥钠进行麻醉，剔除术区毛发。模型组和补肾活血方组小鼠结扎两侧输卵管后，剪去卵巢；
假手术组小鼠结扎两侧输卵管后剪除卵巢旁部分脂肪组织。术后将小鼠置于37 ℃环境中约20 min进行复温，具体时间以小鼠恢复排便或行动为准。
2.2 药物干预从造模术后第2天开始，补肾活血方组使用折合生药浓度为1.5 g·mL-1的补肾活血方浓缩剂灌胃，每次0.4 mL；
假手术组和模型组小鼠以等量生理盐水灌胃。3组小鼠均每天灌胃1次，连续灌胃8周。
2.3 实验指标检测药物干预结束后第2天，将所有小鼠腹腔过量注射0.3%戊巴比妥钠麻醉后脱颈处死，取股骨远端进行观察分析。
2.3.1骨组织微结构观察 采用Micro-CT对小鼠的股骨远端进行扫描，设置参数：管电压90 kV，管电流450 mA，分辨率9 μm。以股骨远端骺线距近端50层为起点，计量100层，使用N-Recon软件进行三维图像重建，观察骨组织的微结构变化情况，并通过CT-AN软件分析股骨骨密度。
2.3.2髓腔中脂肪空泡数量观察 将股骨远端组织置于14%EDTA溶液中脱钙15 d，脱水后石蜡包埋切片，切片厚度0.5 μm。选取部分切片进行阿尔新蓝-苏木素染色后，在光镜下观察各组小鼠股骨髓腔中脂肪空泡数量。
2.3.3骨组织中脂肪酸结合蛋白4表达情况检测 取部分骨组织切片脱蜡复水后，使用0.01 mol·L-1柠檬酸钠在60 ℃下浸泡4 h进行抗原修复。以内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育30 min后，使用10%山羊血清进行封闭。滴加以PBS缓冲液稀释的脂肪酸结合蛋白4(fatty acid-binding protein 4，FABP4)抗体(FABP4抗体∶PBS缓冲液=1∶300)后于4 ℃过夜。次日复温后滴加酶标山羊抗兔IgG聚合物，二氨基联苯胺显色5 min，苏木素复染，然后依次经过1%盐酸酒精分化、脱水、透明处理后以中性树脂封片。显微镜下观察骨组织中FABP4的表达情况，采集图像后使用Image-Pro Plus 6.0软件对图像中FABP4的表达比例进行分析。
2.4 数据统计采用SPSS26.0软件进行数据统计分析。3组小鼠股骨骨密度、股骨组织中FABP4含量的组间总体比较均采用方差分析，组间两两比较均采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。
3.1 一般情况实验期间小鼠饮食、精神状况正常，活动规律，至处死前无小鼠死亡。
3.2 骨组织微结构观察结果Micro-CT图像显示，与假手术组相比，模型组小鼠股骨骨密度明显降低，骨小梁减少；
补肾活血方组小鼠的股骨骨密度和骨小梁数量与假手术组相当(图1)。假手术组、模型组、补肾活血方组小鼠的股骨骨密度比较，差异有统计学意义[(0.033±0.009)g·cm-3，(0.003±0.001)g·cm-3，(0.022±0.009)g·cm-3，F=14.240，P=0.005]；
模型组的股骨骨密度低于假手术组和补肾活血方组(P=0.046，P=0.050)；
补肾活血方组和假手术组的股骨骨密度比较，差异无统计学意义(P=0.203)。
图1 3组小鼠股骨远端Micro-CT图像
3.3 髓腔中脂肪空泡数量观察结果阿尔新蓝-苏木素染色结果显示，模型组髓腔内脂肪空泡数量较假手术组增加；
补肾活血方组髓腔内脂肪空泡数量少于模型组，与假手术组接近(图2)。
图2 3组小鼠股骨远端组织阿尔新蓝-苏木素染色结果(×10)
3.4 骨组织中FABP4表达情况检测结果假手术组、模型组、补肾活血方组股骨组织中的FABP4含量比较，差异有统计学意义[(1.287±0.015)%，(11.897±0.703)%，(0.990±0.162)%，F=800.200，P=0.000]。模型组的FABP4含量高于假手术组和补肾活血方组(P=0.001；
P=0.001)，假手术组的FABP4含量高于补肾活血方组(P=0.034)。见图3。
图3 3组小鼠股骨远端组织免疫组织化学染色结果(×20)
骨髓脂肪细胞被认为是骨髓微环境的重要组成部分，由骨髓间充质干细胞分化而来[6]。脂质是一种与骨质疏松关系密切的生物大分子[7]，骨质疏松症患者的骨髓脂肪组织较健康人群明显增加[8]。Fazeli等[9]的研究发现，绝经后女性骨小梁周围脂肪空泡数量明显上升。Muruganandan等[10-11]的研究证实，脂肪细胞与骨细胞的发育和功能关系密切，能够影响骨重塑过程；
脂肪细胞分泌的可溶性细胞因子会影响成骨细胞分化以及骨吸收功能。
FABP4作为一种脂肪酸结合蛋白，是调节脂肪酸运输和脂质代谢的关键因子[12]，能够调控骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化与脂滴形成[13]，在动脉粥样硬化、乳腺癌、糖尿病等多种疾病的发生发展中起重要作用[14-16]。而且，FABP4也被认为与骨质疏松症的发生密切相关[17]。Song等[18]的研究表明，抑制FABP4的表达能够减少去卵巢小鼠的骨量丢失。
补肾活血方是由经典古方右归饮加减而成，其中熟地黄、枸杞子、山茱萸、山药可补肾阴，杜仲、附子、肉桂善补肾阳，桃仁、红花是活血化瘀的经典药物，甘草调和诸药。相关研究表明，补肾活血方能够通过干预Wnt/β-catenin信号通路影响成骨细胞分化[19]。Wnt/β-catenin信号通路作为骨质疏松症的经典通路，能够调节内源性骨形成[20]，而且对Wnt/β-catenin信号通路的干预也能影响FABP4表达[21]。
本研究的结果提示，通过调控FABP4表达，抑制骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化，可能是补肾活血方治疗PMOP的作用机制之一。
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