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黄立龙，魏 珩，王秋缘，刘春明，刘剑锋，程云清
(1.吉林师范大学吉林省植物资源科学与绿色生产重点实验室，吉林 四平136000；
2.吉林师范大学生命科学学院，吉林 四平136000)
榛子(Corylusspp.)属于桦木科(Betulaceae)榛属(CorylusL.)，是重要的经济林木.随着我国退耕还林政策的实施推广，榛子已经成为山区经济发展的优势树种.榛子种仁可直接食用或制成榛子油、榛子酱及利口酒等加工食品[1-2].榛子的营养价值和经济价值主要来自于种仁.榛子种仁是否饱满与胚珠发育过程是否能顺利进行具有直接关系，而在实际种植中，榛子的胚珠发育障碍问题普遍存在，导致种仁干瘪和空壳现象，造成种仁营养和经济价值的损失[3].因此，深入了解榛子花果发育尤其是胚珠发育的分子机制，对于改良榛子种质，提升质量、提高产量具有重要意义.
生长素(auxin)是植物生长发育中的一种核心调控激素，在营养生长和生殖生长过程中具有重要调节作用.生长素反应因子(auxin response factor，ARF)通过与生长素/吲哚-3-乙酸(auxin/indole-3-acetic acid，AUX/IAA)相互作用实现对生长素的响应和信号调控，是调控下游响应基因的重要转录因子[4-5].ARFs的功能研究在模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)中比较成熟，参与花果发育(AtARF1/2/3/5/6/8/17)[6-8]、叶片生长(AtARF3/4)[9]、根系生长(AtARF7/10/16/19)[10-11]和种子发育(AtARF12/13/14/15/10/21/22)[10]等多种过程[12]，其中AtARF1/2在花的发端和衰老过程中具有重要作用[6].同时ARFs在植物抗逆境胁迫的调控中也扮演重要角色[13-14].目前，在对榛子进行的相关研究中，未见关于ARFs参与胚珠发育乃至花果发育的报道.本文通过对前期研究[15]的榛子胚珠发育转录组数据进行筛选，发现了1个显著差异表达ARF同源基因，命名为ChARF1，通过构建原核表达载体获得了ChARF1(N-380)多克隆抗体，为了解ChARF1基因在榛子胚珠发育中的作用提供了检测材料，研究结果可为进一步发现ARFs在榛子花果发育中的功能机制奠定基础.
1.1 样品采集
实验材料为平欧杂交榛(Corylusheterophylla×C.avellana)，种植于吉林省四平市伊通满族自治县榛园，品种为“达维”，树龄12年，株高3.0～3.5 m.2019年，收集榛子品种“薄壳红”花粉并参照本实验室的研究方法人工授粉[3].于同年8月20日(授粉后120 d)，采集果实并现场解剖，取成熟期胚珠置液氮中，转至实验室后超低温冰箱-80℃保存[15].
1.2 基因筛选及克隆
以前期榛子胚珠发育4个时期(Ov1：胚珠形成期，Ov2：早期胚珠生长期，Ov3：胚珠快速生长期和Ov4：胚珠成熟期)转录组测序数据[15]为基础，筛选差异表达基因.相对表达量以FPKM值(Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)为指标，筛选标准：|log2(倍数变化)|>1且错误发现率<0.05.使用SPSS 8.0 方差分析程序进行差异显著性分析(3次生物学重复).使用Primer Premier 5.0平台设计CDS全长序列引物(F：5′-AGAGAGATGAGTAGTGTTGG-3′，R：5′-ATTGGAATCTAATAGGGATT-3′，产物长度2 129 bp).样品总RNA提取和检测参考Liu 等[15]的方法.以纯度和浓度符合标准的总RNA反转录合成cDNA第一条链，参照SuperScriptTMIV第一链合成系统试剂盒(Invitrogen，USA，18091050)说明书进行操作.使用设计的引物以cDNA为模板扩增筛选基因，纯化后以T4DNA连接酶(宝生物工程有限公司，大连，2040A)连接至pMD18-T载体(宝生物工程有限公司，大连，D103A)并转化大肠杆菌DH5α(唯地生物技术有限公司，上海，DL1001).提取阳性克隆质粒留存并送上海生工有限公司测序.
1.3 基因鉴定及系统发育分析
测序所得序列在NCBI(nucleotide collection nr/nt)和番茄数据库(https:∥phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)进行比对查找同源序列.序列翻译为蛋白后，使用NCBI保守序列数据库CDD(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)和Pfam(http:∥pfam.sanger.ac.uk/)验证序列的保守结构域[16]，随后通过DNAMAN 9.0.1软件进行结构域比对并作图.使用在线工具ProtParam[17](https:∥web.expasy.org/protparam/)预测蛋白相对分子质量.将比对得到的同源序列以及Tair(https:∥www.arabidopsis.org/)网站下载的拟南芥编码序列(Coding sequence，CDS)通过MEGA 7.0[18]软件构建最大似然(maximum likelihood，ML)树，进行系统发育分析[19].
1.4 原核表达载体构建及诱导表达
将包含目的基因的pMD18-T重组质粒送至武汉爱博泰克生物科技有限公司构建原核表达载体并制备多克隆抗体.以重组质粒为模板PCR扩增目的基因N端特异性片段，纯化克隆至pET-28a-SUMO载体(含His-标签，T7-标签，SUMO-标签，相对分子质量约18 000).经PCR和测序鉴定后，提取阳性重组质粒转化E.coliRosetta菌株.将阳性单克隆扩大培养至D(600)=0.5～0.6.设实验组：加入0.8 mmol/L IPTG，37 ℃诱导4 h；
对照组：加入等量无菌水.收集少量菌液进行抗原蛋白表达SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测.验证表达成功后，将剩余菌液离心重悬并用超声波破碎，离心并分离上清和沉淀.使用2和8 mol/L尿素溶解沉淀中的包涵体，期间取上清和溶解包涵体进行抗原蛋白可溶性SDS-PAGE检测.相同条件下进一步扩大培养，收集包涵体蛋白，使用组氨酸标签蛋白纯化试剂盒(碧云天生物技术有限公司，上海)纯化后进行SDS-PAGE检测和浓度测定.
1.5 抗体制备和纯化及蛋白质免疫印迹检测
将纯化后的抗原蛋白分5次免疫两只实验级雄性日本大耳白兔，具体流程见表1.酶联免疫效价检测：设空白对照；
阴性对照：免疫前抽取兔耳静脉血清；
阳性实验：第52天抽取兔颈部抗血清.酶标板每孔加入200 ng纯化抗原蛋白和不同稀释浓度 (体积比为1∶1 000～1∶512 000) 的抗血清，加入二抗进行显色反应，检测D(450)进行效价分析.构建抗原蛋白与琼脂糖耦连的抗原亲和纯化层析柱，抗血清上样洗脱后得到纯化浓缩抗体.以ChARF1(N-380)蛋白作抗原，分别取500 pg，10 ng进行聚丙烯酰胺凝胶电泳.抗体1∶1 000(体积比)倍稀释后做蛋白质免疫印迹检测[20].
表1 免疫流程
2.1 目的基因的鉴定与进化分析
通过对比转录组[15]中胚珠4个时期的相对表达量(FPKM值)，发现1个Ov4显著上调表达基因(unigene)g22071(P<0.05，见图1A).该基因CDS长度为2 115 bp，编码704个氨基酸，预测编码蛋白相对分子质量为78 770.通过核苷酸序列比对程序筛选同源序列以及保守结构域预测，发现该基因同源聚类于胡桃(Juglansregia，XM_035695460.1)、阔叶栎(Quercuslobata，XM_031092776.1)、欧洲栓皮栎(Quercussuber，XM_024058295.1)和扁桃(Prunusdulcise，XM_034371489.1)，参考ARF基因序列(E=0，重合率(identity)>75%)，显著匹配Auxin_resp(pfam06507)、B3(pfam02362)和不显著匹配AUX_IAA(CL0072)结构域[4]见图1B，鉴定g22071属于ARF基因家族，命名为ChARF1(Genbank登录号：MW369441).
A：g22071基因表达分析.相对表达量以FPKM值为标准；
a—c表示差异表达显著水平，P<0.05.B：保守结构域分析.C：系统发育分析.AtARF1-23，拟南芥(Arabidopsis thaliana)；
ChARF1，榛子(Corylus heterophylla × C.avellana)；
SlARF2，番茄(Solanum lycopersicum)；
XM_035695460.1，胡桃(Juglans regia)；
XM_031092776.1，阔叶栎(Quercus lobata)；
XM_024058295.1，欧洲栓皮栎(Quercus suber)；
KP185306.1，梅(Prunus mume)；
XM_034371489.1，扁桃(Prunus dulcise)；
XM_021804856.1，橡胶树(Hevea brasiliensis).
将ChARF1及核苷酸序列比对获得的同源序列和模式植物拟南芥ARF基因家族共31条序列构建ML进化树，结果(见图1C)显示，31条不同物种的ARFs聚类为4个进化分枝(Ⅰ—Ⅳ).ChARF1基因与胡桃、阔叶栎等的ARFs以及拟南芥AtARF1/2、番茄SlARF2基因聚类于分枝Ⅰ.在分枝Ⅰ内，ChARF1基因与胡桃的ARF(XM_035695460.1)同源性最高，而与已报道的拟南芥AtARF1/2基因[6-8]和番茄SlARF2基因[21]同源关系相对较远.拟南芥AtARF3-23基因则聚类于Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ分支.
2.2 原核表达载体的构建及表达
选择ChARF1基因序列N端包含Auxin_resp和B3保守结构域(见图1B)的前380个氨基酸为抗原特异性片段，以测序正确的pMD18-T-ChARF1质粒为模板进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测产物大小正确(见图2A).构建pET-28a-SUMO-ChARF1(N-380)重组载体后，测序鉴定结果显示目的片段成功克隆至重组载体，载体构建成功.
A：PCR扩增结果.1：Marker(相对分子质量标准)，2：ChARF1(N-380).B：蛋白表达检测.1：0.4 mg/mL 牛血清白蛋白，2：Maker，3：pET-28a-SUMO-ChARF1(N-380)未诱导表达，4：pET-28a-SUMO-ChARF1(N-380)诱导表达，5：pET-28a-SUMO-ChARF1(N-380)诱导表达.C：可溶性检测.1：0.4 mg/mL 牛血清白蛋白，2：Marker，3：上清，4：上清2(2 mol/L尿素溶解)，5：包涵体2倍稀释(8 mol/L尿素溶解)，6：包涵体5倍稀释(8 mol/L尿素溶解).D：纯化检测.1：0.4 mg/mL 牛血清白蛋白，2：Marker，3：包涵体10倍稀释(8 mol/L尿素溶解)，4：包涵体20倍稀释(8 mol/L尿素溶解).
将阳性pET-28a-SUMO-ChARF1(N-380)载体转化至E.coliRosetta菌株进行表达.完整的ChARF1蛋白相对分子质量大小推测为78 770，而ChARF1(N-380)相对分子质量推测为43 000.重组蛋白融合了相对分子质量为18 000的His-标签、T7-标签、SUMO-标签，实际表达产物预期相对分子质量高于61 000.聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，实验组与对照组相比，在相对分子质量为66 000的条带处可观察到特异性条带(见图2B)，符合预期大小，表明ChARF1(N-380)在E.coliRosetta菌株中成功表达.
2.3 抗原蛋白的可溶性检测及纯化
经超声波破菌后，取上清和沉淀进行ChARF1(N-380)抗原蛋白可溶性检测，结果(见图2C)显示在相对分子质量为66 000处，上清及上清2(2 mol/L尿素溶解包涵体)，条带不清晰；
而在沉淀中，通过使用8 mol/L尿素溶解包涵体，可观察到明显的条带.表明ChARF1(N-380)抗原蛋白表达主要在包涵体中，具有不溶性.
抗原蛋白ChARF1(N-380)具有6个氨基酸的His-标签，可使用His标签蛋白纯化试剂盒纯化.纯化前非特异性条带较多(见图2C)；
纯化后非特异性条带基本消失，在相对分子质量为66 000处抗原蛋白条带清晰(见图2D).依据BSA蛋白条带进行蛋白浓度估算约为12 mg/mL，包涵体20倍稀释液仍可观察到明显条带.结果证明，ChARF1(N-380)抗原蛋白的纯度和浓度已经达到免疫要求.
2.4 多克隆抗体的制备及效价分析
将纯化后ChARF1(N-380)抗原蛋白免疫2只雄性日本大耳白兔，获得E7200和E7201抗血清.对抗血清进行酶联免疫效价检测，结果见表2.在不同稀释浓度下，E7200和E7201血清中抗体与抗原蛋白发生了特异性结合，显色反应明显.根据(D阳性-D空白)/(D阴性-D空白)>2.1标准，E7200和E7201抗血清效价皆可达到1∶512 000.
表2 ChARF1(N-380)抗血清ELISA效价检测
2.5 多克隆抗体的纯化及WB检测
亲和纯化用蛋白ChARF1(N-380)经检测浓度为4 mg/mL，与破菌纯化后的浓度和纯度差异不大，可进行抗原亲和纯化.亲和纯化得到抗体E7200和E7201，浓度分别为4.09，4.67 mg/mL.将抗体稀释(体积比为1∶1 000)后进行WB检测，抗体E7200和E7201检测抗原印记在相对分子质量为67 000左右，随抗原上样量减少印记变浅，最低可检测到500 pg抗原(见图3A，B).抗体E7200和E7201浓度正常，能够特异性检测ChARF1(N-380)抗原蛋白.
图3 ChARF1(N-380)抗体的蛋白质免疫印迹检测
生长素在植物花果发育过程中扮演重要角色.ARFs作为重要的转录因子可直接与下游靶基因结合并激活或抑制靶基因在花果发育过程中的表达，从而影响植物的生殖生长[22-23].在本文的研究中，榛子ChARF1基因表达水平从Ov2期开始随着胚珠的发育逐步上升，在Ov4期达到最大，推测ChARF1基因在胚珠发育过程中具有正调控作用.系统发育分析表明，榛子ChARF1基因与胡桃JrARF基因(XM_035695460.1)高度同源(见图1B)，二者同为可食用干果，种仁含油量较高.其他比对到的同源序列涉及阔叶栎、欧洲栓皮栎和扁桃等，则为干果类林木.目前同源性高的匹配序列多为预测参考序列，未见相关的功能研究的报道，通过对榛子ChARF1基因与胚珠发育的研究，将有助于加深对此类植物胚珠发育机制的理解.此外，ChARF1基因与拟南芥ARFs基因家族的AtARF1/2基因、番茄SlARF2基因聚类于进化分枝Ⅰ(见图1B)，AtARF1/2基因影响花的发端和衰老，二者在部分功能上存在冗余，AtARF2基因还具有独立于乙烯和细胞分裂素外调控花器官脱落功能[6-8]；
SlARF2基因在番茄中参与花器官的衰老调控和果实发育过程[21].综上推测，ChARF1基因在胚珠发育过程中发挥重要作用，同时还可能具有AtARF1/2和SlARF2基因的类似功能，参与榛子花的发育和花器官脱落过程.
为进一步验证ChARF1基因的功能机制，本研究通过构建pET-28a-SUMO-ChARF1(N-380)原核表达载体成功诱导表达ChARF1(N-380)抗原蛋白，首次获得了能够特异性检测榛子ChARF1基因相关蛋白的多克隆抗体E7200和E7201，为后续研究提供了检测材料.由于本次克隆的ChARF1基因是以cDNA为模板扩增的CDS序列，后续还应以gDNA为模板通过5′-RACE和3′-RACE检测基因的完整性，在获得基因完整的序列信息后，进行ChARF1基因序列以及榛子ARF基因家族的系统生物信息学分析和分子功能研究，将有助于深刻揭示ARFs在榛子胚珠发育中所扮演的角色.
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