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黎 珊 蓝瑞隆 潘晓娴 王彩虹 洪金省
1）福建医科大学附属第一医院，福建 福州 350005 2）放射生物福建省高等学校重点实验室，福建福州 350005
放射性脑损伤（radiation-induced brain injury，RBI）是颅脑、头颈部肿瘤放射治疗后的常见并发症，对脑肿瘤进行放射治疗时，周围正常脑组织不可避免地暴露于辐照区，进而引起放射性脑损伤［1-2］。随着肿瘤综合治疗的广泛应用及影像诊断技术的日益发展［3-4］，RBI的发生率呈逐步上升趋势［5］。值得注意的是，临床提高放疗剂量有利于改善预后，但放射性脑坏死等放疗不良反应制约着放疗的应用，影响患者的治疗效果［6-7］。放射性脑病一旦出现难以逆转，在严重的情况下多影响到患者的生活质量和生存期［8-9］。然而，RBI 的确切机制尚未明确，临床上尚缺乏有效的防治方法［5］。
放射性脑损伤过程中伴随多种免疫细胞、免疫因子的相互作用［10-11］。小胶质细胞是中枢神经系统中主要的免疫细胞，与脑内炎症密切相关。放疗的过程可以激活大脑内小胶质细胞，诱导脑组织内的神经炎症反应，引起脑组织损伤，进而产生不可逆的神经功能损害，因此，小胶质细胞在放射性脑损伤的发生发展过程中占据重要地位［12-13］。
甘草主要有效成分包括甘草酸、甘草次酸、甘草苷等，其中甘草酸含量最高，甘草酸可在肠道进一步水解脱去糖酸键形成的功能性产物甘草次酸（lycyrrhetinic acid，GA）而进入血液循环，同时甘草次酸也作为评价甘草质量标准的物质之一，其具有类固醇样抗炎作用及肾上腺皮质激素样药理作用，且无严重不良反应［14］，已有研究证实GA有助于放射性肺炎［14］等防治，但GA 是否有助于减轻放射性脑病，目前尚未有研究报道。鉴于以上因素，本研究通过体外培养小胶质细胞BV2 细胞系，使用电离辐射刺激细胞，构建体外RBI模型，并使用GA干预细胞，探索GA在小胶质细胞RBI过程中的影响作用，为深入研究GA 在放射性脑损伤中的作用机制提供可能的理论依据。
1.1 细胞与主要试剂小鼠小胶质细胞BV2 细胞，购自武汉普诺赛生命科技有限公司。甘草次酸，购自购自德国Sigma 公司。小鼠白细胞介素-1β（IL-1β）购自中国欣博盛公司；
ROS活性氧检测试剂盒购于中国南京凯基公司；
Anti-Heme Oxygenase 1 抗体、Anti-Caspase-1 抗体、重组Anti-NLRP3 抗体均购自英国Abcam 公 司；
HO-1 Antibody-Internal、Caspase 1 Antibody-C-terminal、NLRP3 抗体均购自美国Affinity公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞分组与照射：将培养基血清浓度调整为2%，将BV2 细胞分为4 个组别：①空白对照组；
②二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）（溶剂）对照组；
③GA 干预（1 μg/mL）组；
④地塞米松干预（10 nmol/L）组。照射方法：药物预处理3 h 后，使用4 Gy 6 MV X 线单次电离辐射各组细胞（剂量率500 MU/min），6 h后检测各项指标的变化。
1.2.2 CCK8法测定细胞存活率：将BV2细胞铺板至96 孔板中（5 000 cells/well），采用高糖DMEM 完全培养基梯度稀释甘草次酸至工作浓度为100 μg/mL、50 μ g/mL、10 μ g/mL、1 μ g/mL、0.1 μ g/mL、0.01 μg/mL ，使用甘草次酸干预48 h 后，去除原培养液，PBS 冲洗3 遍，加入PBS 100 μL，向每孔加入10 μL CCK-8溶液。将培养板放置培养箱内孵育6 h后，应用酶联免疫检测仪，在450 nm双波长处测得相应吸光度。
1.2.3 流式细胞术检测ROS 表达水平：将BV2 细胞设置为：空白对照组、DMSO（溶剂）对照组、地塞米松干预组（10 nM）、GA 干预组（1 μg/mL）、GA 干预组（10 μg/mL）、DMSO+IR 干预组、地塞米松组（10 nM）+IR 干预组、GA（1μg/mL）+IR 干预组、GA（10 μg/mL）+IR 干预组；
上述药物预处理3 h 后采用4 Gy X线照射处理（剂量率5 00 MU，6 MV X射线），6 h 后检测ROS 水平。将不同分组的细胞弃去培养基，使用PBS清洗后添加胰酶消化，收集细胞置于EP管中，1 500 r/min 离心3 min后，弃去上清，重悬。按体积比1：1 将AM 酯加入到各组细胞悬液中，37 ℃孵育60 min。去掉加载液，使用无血清的细胞培养液洗涤细胞2次，1 000 r/min 离心5 min，弃上清，使用200 μL PBS 使细胞悬浮。采用流式细胞仪484 nm的激发光检测ROS水平。
1.2.4 BCA 法检测蛋白浓度：据据分组培养细胞，48 h 后吸取各组上清液，经1 000 r/min 离心15 min后吸取上清于-80℃保存，通过碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL 加到96 孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20 μL（相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 稀释），取各组20 μL 待测蛋白质样品加入到微孔板中，加入200 μL BCA 工作液混匀。37 ℃反应30 min后用酶标仪于562 nm 波长处测定吸光度，重复测定3 次。所得标准曲线见图1。
图1 BAC蛋白浓度曲线Figure 1 BAC protein concentration curve
1.2.5 IL-1β的表达水平检测：按上述分组对细胞进行干预，各组细胞上清经BCA 蛋白定量法调整各组蛋白量至一致，按照IL-1β ELISA 试剂盒说明书进行操作，检测各组细胞上清中IL-1β的表达水平。
1.2.6 Westernblot 检测各标记物水平：将BV2 细胞分为：空白对照（未照射未给药）、溶剂对照组（DMSO）、甘草次酸干预组（1 μg/mL）、地塞米松干预组（10 nM）。4 Gy 6 MV X 线（剂量率500 MU）单次照射照射组BV2细胞。干预72 h后，收集细胞，加入细胞裂解液裂解细胞，提取细胞蛋白样品并定量。取总蛋白与5×上样缓冲液按照4：1 混合，变性后于8% SDS 聚丙烯酰胺凝胶上电泳。经转膜，5%脱脂奶粉封闭，分别加一抗（NLRP3/β-Tubulin/HO-1/Caspase-1）4 ℃孵育过夜。经TBST 充分洗涤，采用各抗体的同源二抗孵育，TBST 洗涤，用化学发光试剂盒定影显影。
1.3 统计学处理所有数据采用SPSS 20.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，然后使用Tukey 法（Tukey’s multiple comparisons test）进行多重比较。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 GA干预对BV2 细胞存活率的影响BV2 细胞置于不同浓度的GA处理72 h后，通过CCK-8检测细胞存活率，发现BV2细胞经GA干预后细胞存活率降低，但不同浓度GA干预的BV2细胞存活率改变幅度并不显著（P＞0.05），10 μg/mL 时细胞存活率最高为73.876%，1 μg/mL 时次高67.226%，100 μg/mL 时达最低点55.780%。考虑到过大剂量GA细胞毒性较大可影响细胞正常存活，因此使用1 μg/mL、10 μg/mL作为GA干预剂量（图2）。
图2 CCK-8检测BV2细胞存活率Figure 2 Survival rate of BV2 cells detected by CCK8
2.2 GA干预对GY射线照射后BV2细胞内ROS含量的影响流式细胞术结果显示，BV2 细胞照射0 Gy时，甘草次酸干预组（1 μg/mL）的ROS含量较空白对照组（94.900% vs 41.650%，P=0.000）、溶剂对照组（DMSO）（94.900% vs 21.700%，P=0.000）、GA 组（10 μg/mL）（94.900% vs 78.400%，P=0.000）明显上调，但与地塞米松组（10 nM）（94.900% vs 93.533%，P=0.999）相比差异无统计学意义。经4 Gy射线照射后，GA 组（1 μ g/mL）的ROS 含量较溶剂对照组（DMSO）（14.567 % vs.7.167%，P=0.025）同样明显上调，而与地塞米松组（10 nM）（14.567 % vs 12.900%，P=0.995）相比，ROS含量差异无统计学意义（图3）。
图3 甘草次酸干预后ROS的变化Figure 3 ROS changes after GA intervention
2.3 GA 干预对GY 射线照射后BV2 细胞内IL-1β水平的影响经BCA 定量调整蛋白浓度一致后，ELISA结果显示：经4 Gy射线照射后，Cont对照组（4 Gy）较未照射Cont 对照组（0 Gy）IL-1β的水平明显升高（0.212 vs 0.087，P=0.000）。在甘草次酸（1 μg/mL）的干预下，GA组（4 Gy）的IL-1β的水平为4组中最低含量（0.156）。但与空白对照组（0.156 vs 0.212，P=0.131）、溶剂对照组（DMSO）（0.156 vs 0.176，P=0.999）、地塞米松干预组（10 nM）（0.156 vs 0.184，P=0.961）相比，各组间IL-1β的含量差异均无统计学意义。见图4。
图4 甘草次酸干预后IL-1β水平的变化Figure 4 Changes of IL-1β levels after GA intervention
2.4 GA 干预对GY 射线照射后BV2 细胞内HO-1、Caspase-1蛋白水平的影响Western blot结果显示，给予4 Gy照射后，GA+IR组的Caspase-1相对蛋白水平较Cont+IR 组（0.147 vs 0.243，P=0.000）、DMSO+IR组（0.147 vs 0.590，P=0.000）、Dex+IR（0.147 vs.0.565，P=0.000）组均明显下调，差异均有统计学意义。然而给予4 Gy 照射后各组的HO-1 相对蛋白表达水平呈上调趋势，且GA+IR 组与Cont+IR 组（0.537 vs.0.313，P=0.000）、DMSO+IR 组（0.537 vs.0.113，P=0.000）、Dex+IR 组（0.537 vs.0.047，P=0.000）相比，差异均有统计学意义（图5）。
图5 甘草次酸干预后Caspase-1、HO-1 的变化（***P＜0.001 vs Cont）Figure 5 Changes of Caspase-1 and Ho-1 after GA intervention（***P＜0.001 vs Cont）
RBI的发生机制错综复杂，目前尚未明确其发生的确切机制［15-16］。传统的治疗方法如手术、高压氧［17］、血管内皮生长因子［18］、糖皮素激素等只能缓解症状［19］，无法逆转放射性脑损伤，存在一定的局限性［20-23］。因此，对于RBI 治疗药物的研究具有重要的实用价值。小胶质细胞是大脑中重要的内源性免疫细胞，在中枢神经系统的损伤过程中［24-25］，包括放射性损伤的病理过程中起着重要作用［26］。甘草次酸已证实在放射性肺炎等损伤中体现出抗炎、抗氧化等多重作用。本研究中探索了BV2 小胶质细胞经X 线照射后，通过使用甘草次酸的干预，检测细胞生物学行为的变化，结果显示GA 10 μg/mL+IR 组相较于Cont+IR 组、DMSO+IR 组、IR+DMSO 组、Dex+IR 组明显下调了Caspase-1 蛋白的含量，增加了HO-1 蛋白的水平，表明GA在脑损伤的过程中具有抗小胶质细胞凋亡，并增加其抗氧化的能力，具有一定的神经保护作用。
本研究采用电离辐射X 射线照射小胶质细胞，模拟体外脑损伤模型。电离辐射可以激活体内的小胶质细胞，产生脑组织炎症及脑功能损伤，导致认知功能障碍［27-28］。小胶质细胞是介导神经炎症的关键细胞［29-30］，研究表明BV2 细胞受到电离辐射时，能刺激炎症反应的产生，包括ROS［31］、NLRP3［32］、IL-1β［33］等，破坏了体内氧化-抗氧化平衡，引发下游的炎症级联反应，对正常细胞及组织造成损伤并引脑内神经细胞凋亡及神经炎症反应［34-35］。MISSIRY 等［36］研究同样发现射线照射后可激活小细胞质胞，引起IL-1β、TNF-α增加，ROS 的生成增加。因此，小胶质细胞激活可能是引发放射性脑损伤的关键因素，通过抑制大脑内小胶质细胞的炎症反应尤为重要。本研究以BV2 细胞为研究对象，接受4 Gy X 射线照射后，GA+IR组与Dex+IR组相比较，ROS、IL-1β等指标呈现下调趋势，说明GA在BV2细胞受到电离辐射刺激时发挥了一定的抗氧化、抗炎的作用，可能具有一定的神经保护作用，但组间比较差异无统计学意义。这可能提示ROS、IL-1β可能是下游的指标，GA可能通过影响其他上游的炎症指标发挥其抗炎、抗氧化的作用。
因此，本文进一步使用Western blot 检测了其他炎症相关的指标。本研究发现了GA+IR组明显下调了Caspase-1的含量，Caspase与真核细胞凋亡密切相关，并参与细胞的生长、分化与凋亡调节［37，38］，与此同时，还发现GA 的干预导致BV2 细胞内HO-1 蛋白的表达水平上调，HO-1 是一种抗炎、抗氧化和具有神经保护作用的诱导酶［39-40］，这说明GA在减轻脑内胶质细胞凋亡，减轻神经炎症的同时，增加了细胞的抗氧化能力，发挥一定的神经保护作用。同时，本文也存在以下不足之处：（1）本文发现GA 的神经保护作用可能是通过降低凋亡信号通路发挥作用，但未深入研究其确切的机制，后续应进一步深入研究；
（2）本文表明GA 具有神经保护作用，但是未确定是GA中的哪种化合物发挥的作用，后续可通过生物信息学、网络药理学等其他手段进一步分析其确切的组分。
GA 在放射性脑损伤过程发挥了抗凋亡、抗炎、抗氧化的作用，GA有可能成为临床上治疗放射性脑损伤的潜在药物之一。
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