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张 锋, 阿茹拉, 李 斌
(东北林业大学 化学化工与资源利用学院， 黑龙江 哈尔滨 150040)
邻苯二酚(C6H6O2)作为重要化工原料用于合成农药、化妆品、染料、涂料稳定剂等，在诸多领域有着非常重要的应用[1,2].但同时，邻苯二酚会不可避免地释放到环境中，成为工业废水中一种环境污染物.而存在于废水中的邻苯二酚不易降解、很难去除，污染生态环境，对人类身体健康造成危害，即使超低浓度的邻苯二酚也会致癌，世界卫生组织国际癌症研究机构将其归为2B类致癌物[3].正由于邻苯二酚对生态环境和人类身体的危害受到广泛关注，建立废水中灵敏准确的检测方法显得尤为重要.当前常用检测邻苯二酚的方法有紫外分光光度法[4]、色谱法[5]、荧光分析法[6]和电化学法[7]等.与其他方法相比，电化学法具有响应速度快、灵敏度高、耗费少及易实现在线监测等优点而受到广泛关注[8].
漆酶是一种具有较高催化还原活性的多铜氧化酶，但漆酶的活性中心包裹着不导电的肽链，直接利用其开发酶电极难以实现酶与电极之间的电子转移.引入电子介体是实现酶-电极间电子迁移的有效方法，但是引入介体会降低电池能量输出，从而造成酶电极的使用稳定性较差[9,10].近年来，开发具有良好导电能力的纳米材料作为漆酶固定载体，已成为开发漆酶电化学传感器的首选方案.介孔碳材料(孔径2～50 nm)具有较大比表面积和孔容、可调节且规则有序的孔道结构，优异的力学性能、化学稳定性和生物相容性，使其成为优良的酶固定载体[11].此外有序介孔碳良好的导电性和纳米尺寸效应，使其表面原子具有很高的反应活性，表面活性基团如羟基、羧基等可深入还原酶活性中心附近，为电子传递提供高效的纳米通道[12].因此，有序介孔碳作为酶固定载体为漆酶生物传感器的开发和应用提供了前所未有的机遇.
高浓度纤维素纳米晶(NCC)水溶液能自组装形成具有左旋手性的胆甾相液晶，随着溶剂的缓慢蒸发其手性向列型结构可以保持并形成具有长距手性向列型特征的薄膜[13].利用这一特性，Kevin E.Shopsowitz等[14]以NCC为模板，正硅酸甲酯为硅源前驱体调控制备了手性向列型介孔碳，但该介孔碳材料在酶生物传感器的开发应用领域却鲜有报道.本文以手性向列型介孔碳为载体，通过物理吸附固定了漆酶，制备了漆酶电极，研究了漆酶生物传感器对邻苯二酚的直接电化学行为和催化氧化还原性能，成功应用于邻苯二酚的定量检测.与其他方法相比，该漆酶传感器具有较高的灵敏度，较低的检测限和很好的抗干扰能力.
1.1 试剂与仪器
1.1.1 主要试剂
漆酶(EC1.10.3.2，600 U/g),江苏锐阳生物科技有限公司；
邻苯二酚标准溶液(1 000μg/mL)，2,2"-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS，98%)，聚二烯二甲基氯化铵(PDDA，20 %)，Aladdin生化科技有限公司；
浓硫酸(98%，优级纯)，科密欧试剂公司；
Na2HPO4、NaH2PO4、正硅酸甲酯、氢氧化钠、柠檬酸等均为分析纯，国药试剂有限公司；
巴西鹦鹉牌桉木浆,牡丹江恒丰纸业有限公司.
1.1.2 主要仪器
全自动比表面和孔隙度分析仪(BELSORP-miniII)，麦奇克拜尔有限公司；
扫描电镜(EM-30 plus)，韩国库塞姆公司；
紫外分光光谱仪(Lambda 750)，美国Perkin Elmer公司；
电化学工作站(AUTOLAB)，瑞士万通公司；
气氛管式炉(TCGC-1200)，上海仝科电炉设备有限公司.
1.2 手性向列型介孔碳的制备与表征
采用浓硫酸酸解的方法制备NCC[15].将30 g桉木浆加入到300 mL 64 wt%硫酸中，50 ℃水浴下机械搅拌1 h，加入10倍冷去离子水(4 ℃)终止酸解反应.稀释后的悬浮液反复离心洗涤，将乳白色胶体转移至透析袋透析至中性，最后将NCC分散液稀释至浓度为2.4 wt%.取超声分散后的NCC 20 mL，在机械搅拌下缓慢滴加适量正硅酸甲酯，60 ℃下搅拌3 h.混合液冷却至室温后，倒入Φ60 mm聚苯乙烯培养皿中，自然通风挥发48 h，形成NCC-SiO2复合薄膜.将复合膜剪成1 cm宽碎片，在N2保护900 ℃下煅烧6 h.使用2 M NaOH溶液将煅烧后的复合碳材料在90 ℃下碱蚀4 h去除SiO2，过滤，分别用去离子水、乙醇洗涤，105 ℃干燥至恒重，得手性介孔碳.手性向列型介孔碳的制备流程如图1所示.以NCC-SiO2复合膜中NCC的不同含量100%、75%、65%和55%，将所得手性介孔碳命名为CNMC-1、CNMC-2、CNMC-3和CNMC-4.
图1 介孔碳制备流程
N2等温吸附脱附测试：准确称取一定质量样品，使用BelSorp-Mini型全自动比表面及孔隙度分析仪绘制吸附等温曲线，采用BET法分析手性介孔碳的比表面积、孔径分布和孔容大小.
介孔碳形貌观察：将介孔碳横断面喷金，用SEM观察拍照，加速电压20.0 kV.
1.3 介孔碳固定化漆酶及酶活稳定性评价
取200 mg介孔碳粉末加入到浓硫酸与浓硝酸混合液(3∶1，v/v)中,超声分散10 min后，继续在室温下磁力搅拌18 h，使用0.22μm微孔滤膜抽滤，去离子水洗涤至弱酸性，最后在60 ℃下真空干燥，得酸化介孔碳.取40 mg酸化介孔碳粉末，加入40 mL 漆酶溶液(1 mg/mL)，在4 ℃循环水浴下搅拌24 h,保证酶充分吸附固载于介孔碳材料上，离心分离，除去上层清液得有序介孔碳固定化漆酶.
采用ABTS为底物评价固定化漆酶和游离漆酶活性[16].将适量固定化漆酶或游离漆酶加入到含有1 mM ABTS 底物的磷酸盐缓冲溶液中，控制总体积为3 mL,反应时间5 min,使用分光光度法监测反应后氧化产物ABTS+(ε420=36 000 L mo-1cm-1)在420 nm下的吸光度变化，根据式(1)计算酶活力.
(1)
式(1)中：△A为反应前后420 nm下吸光度变化值；
V为反应溶液总体积,L；
t为反应时间；
n为ABTS物质的量,mol；
m为固定化酶或游离酶质量，mg.酶活力(1U)定义为每分钟催化氧化1μmol反应底物所需酶量.
使用含有ABTS 底物的磷酸盐缓冲溶液，分别在不同pH(pH 3.0～8.0)和不同温度(20 ℃～80 ℃)下测定固定化酶和游离酶的活力，评价固定化酶和游离酶的pH和温度稳定性.将同一批次实验中的最高活性值定义为100%，其余活性为最高活性的相对比值.
1.4 漆酶电极制备及电化学测试
称取5 mg固定化漆酶，加入少量水和50μL Nafion溶液，在150 w功率下超声分散.将Au电极打磨，去离子水反复清洗后，放置于pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液中进行循环伏安活化.Au电极活化后放置于20 wt%的PDDA溶液中浸泡30 min，去离子水冲洗.取10μL固定化酶分散液滴在Au电极，静置1.5 h形成薄膜，去离子水洗去多余残渣，得漆酶生物传感电极，命名为CNMC/Lac/Au电极.
电化学测试采用三电极体系，Au电极(漆酶传感电极)为工作电极，Pt电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极.设定电压为-0.3～0.6 V，扫描速度为0.05 V/S进行循环伏安测试.使用最高电压值测定不同浓度邻苯二酚溶液以获得时间-电流响应图.
2.1 手性向列型介孔碳的表征
通过N2等温吸附-脱附法分析手性介孔碳的孔隙度，不同NCC-SiO2复合膜热解所得介孔碳等温吸附曲线如图2所示，获得比表面积及空隙数据列于表1.未添加正硅酸甲酯前驱体的NCC薄膜热解后生成微孔碳(CNMC-1)，等温吸附脱附曲线属于典型的第Ⅰ类吸附等温线，在低压力区域(p/p0<0.1)吸附量快速增长，微孔吸附充满后达到饱和平台.添加硅源前驱体的NCC薄膜热解后形成的碳材料(CNMC-2,3,4)，吸附等温线表现为典型的第Ⅳ类吸附等温线，在中高压力区域(0.4
图2 手性向列型介孔碳N2等温吸附曲线
如表1所示，当NCC占NCC-SiO2复合膜质量比为65%时，所得介孔碳材料(CNMC-3)BET比表面积高达449 m2g-1，孔体积为0.51 cm3g-1，平均孔径5.43 nm.而NCC与正硅酸甲酯前驱体的比例降低或者升高，所得碳材料(CNMC-2,4)的比表面积、孔体积和平均孔径均呈下降趋势.适量硅源的引入可以使碳材料形成中孔，硅源过少，碳材料形成的微孔比例较大，而过量硅源会形成较厚的硅层，在复合薄膜热解过程中阻止了介孔碳区域的形成[17].CNMC-3碳材料微孔比表面积11 m2g-1，相对于449 m2g-1的总比表面积，微孔占比很小，反映出NCC在碳化前已形成高度有序的微观结构.
表1 不同介孔碳样品N2吸附数据
介孔碳(CNMC-3)的SEM图片证实其手性向列型微观结构，如图3所示.手性介孔碳具有光滑的表面(如图3(a)所示)，但断面SEM照片(如图3(b)、(c)所示)显示介孔碳具有垂直于表面的层状结构，层级界限依稀可见.在高放大倍数下(如图3(d)所示)可观察到介孔碳材料保持着NCC的棒状形态，且以逆时针旋转方向堆积，基本保持着NCC模板的左旋手性向列相结构[15,17].因此，加入正硅酸甲酯前驱体在碳材料中引入中孔的作用之外，还协助NCC薄膜在高温碳化过程中保持长程手性向列相微观结构.
(a)介孔碳电子照片 (b)、(c)、(d)分别为介孔碳横断面×1 200、×2 400、×9 400放大倍数SEM照片图3 介孔碳(CNM-3)的电子照片和断面SEM照片
2.2 固定化漆酶pH和温度稳定性
固定化漆酶稳定性是漆酶生物传感电极实际应用的重要保证，因此采用ABTS为底物研究了溶液pH和反应温度对游离漆酶和固定化漆酶相对酶活力的影响.不同pH值对游离漆酶和固定化漆酶相对活力的影响如图4所示.漆酶吸附固定到介孔碳上后，其最适pH没有发生变化，仍为5.0.然而在pH 3.0～7.5范围内，介孔碳固定化漆酶的相对酶活力明显好于游离漆酶，特别是在pH3.0～6.5范围内，固定化漆酶的相对酶活力均保持在80%以上，而游离漆酶仅保持60%的活性.这说明介孔碳固定化漆酶具有更好的pH稳定性，可能由于漆酶固定于介孔碳载体后，结构不易发生变化，对环境pH变化具有更好的适用性[18].
图4 pH值对漆酶活性的影响
在漆酶电极使用过程中，提高酶的温度适用性有利于提高系统稳定性.图5描述了反应温度对游离漆酶和固定化漆酶相对活力的影响.固定化漆酶和游离漆酶的最适温度均为45 ℃，但在实验所使用温度范围内，介孔碳固定化漆酶在更宽的温度范围(30 ℃～60 ℃)保持80%以上的相对酶活力，这说明漆酶与介孔碳之间形成了较强的相互作用，使酶分子具有更好的抗热失活能力.据文献报道[19]，工业废水的pH值在4.0～9.0之间、温度在60 ℃以下，介孔碳固定化漆酶pH适用性和热稳定性的提升，更有利其应用于工业废水中酚类物质的在线监测.
图5 温度对漆酶活性的影响
2.3 漆酶电极的电催化氧化性能
如图6所示，当待测溶液(pH 5.6 PBS缓冲溶液)中不含邻苯二酚时，CNMC/Lac/Au电极的CV曲线没有氧化还原峰；
而当加入0.5 mmol/L邻苯二酚溶液后，在0.1～0.4 V之间明显观察到一对氧化还原峰，表明邻苯二酚在介孔碳固定漆酶修饰电极表面能进行直接的电化学反应，漆酶电极对邻苯二酚具有灵敏响应.
图6 CNMC/Lac/Au电极的CV曲线图
图7为CNMC/Lac/Au电极在pH 5.6、工作电压0.35 V的测试条件下，在PBS缓冲溶液中连续加入一定浓度邻苯二酚进行计时电流法测量而得到的电流响应-时间曲线，该曲线反映了漆酶电极的响应电流随待测溶液中底物浓度增大的动态变化过程.从图7中可以观察到响应电流随着邻苯二酚浓度的增大呈阶梯式增长，相同邻苯二酚添加量所引起的电流增大值基本相等，且在同一浓度下的响应曲线较为平滑，表明漆酶电极对邻苯二酚具有良好稳定的电流响应.
图7 CNMC/Lac/Au电极的响应电流-时间(I-t)曲线
如图8所示，当邻苯二酚浓度在1.1～22.8μmol/L范围内，随着邻苯二酚浓度增加，响应电流随之增大，并且与邻苯二酚浓度呈现良好的线性响应，其线性回归方程为：i(μA)=0.132 5+0.0158 5c(μmol/L)，拟合线性相关系数R2达0.999 2.但邻苯二酚浓度超过22.8μmol/L后，响应电流逐渐趋于稳定值.由此表明漆酶传感器对邻苯二酚的线性响应范围为1.1～22.8μmol/L，选择灵敏度为0.016 A/(mol/L)，检测限为0.217μmol/L(S/N =3).
图8 CNMC/Lac/Au电极的响应电流-邻苯二酚浓度关系曲线
2.4 漆酶电极传感器检测邻苯二酚稳定性及回收率
按照上述方法，对10μmol/L邻苯二酚溶液进行6次平行测定，还原峰的相对偏差RSD为2.35%；
对10μmol/L邻苯二酚溶液连续测定20次，其峰电流仅下降1.05%，由此表明CNMC/Lac/Au电极检测邻苯二酚的重现性和稳定性较好.在相同实验条件下，考察了干扰物对邻苯二酚测定的影响，实验结果表明，1 000μmol/L的L-络氨酸、甘氨酸、葡萄糖，2 000μmol/L的K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Cl-、NO3-、SO42-对检测几乎没有影响.
加标回收实验结果如表2所示，样品测定的回收率为97.05%～104.1%，表明由漆酶电极建立的邻苯二酚测定方法具有很好的准确度，可以应用于实际样品中邻苯二酚的检测.
表2 加标回收实验结果
以纤维素纳米晶为模板，正硅酸甲酯为硅源，配比调控制备了手性向列型介孔碳.当NCC占NCC-SiO2复合膜质量比为65 wt%时，所得碳材料比表面积达449 m2g-1，平均孔径5.43 nm，中孔为主.以介孔碳为载体吸附固定漆酶，固定化漆酶具有更好的pH适用性和热稳定性.固定化漆酶修饰Au电极对邻苯二酚具有良好的电催化氧化作用，漆酶电极构建生物传感器对邻苯二酚的线性检测范围为1.1～22.8μmol/L，选择灵敏度为0.016 A/(mol/L)，检测限为0.217μmol/L.该测定方法具有良好的准确度，适用于实际样品测定，回收率为97.05%～104.1%，1 000μmol/L的L-络氨酸、甘氨酸、葡萄糖以及2 000μmol/L的常规阴、阳离子对邻苯二酚检测几乎没有影响.
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