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马子龙，李海龙，米帅，杜彬，李军，朱凤妹*
1. 河北科技师范学院食品科技学院（昌黎 066600）；
2. 河北科技师范学院河北省天然产物活性成分与功能重点实验室（秦皇岛 066000）
黑果腺肋花楸是一种蔷薇科植物，喜潮湿，来源于北美[1-2]。其提取物具有较强的抗氧化、抗炎和降血脂等功效[3-4]。
黑果腺肋花楸果实酸涩，难以直接食用，这使其发展受到限制，但在欧美等国家，其中富含的花色苷物质被广泛应用于医药和功能性食品行业[5]。花色苷具有良好的抗氧化活性，可以清除人体内多余的氧化自由基，研究发现花色苷可以显著抑制内皮细胞中活性氧（ROS）的升高，同时抑制抗氧化活性酶的降低[6-7]。
当前摄入花青素的方式仍为食补，关于其制剂的研究非常少。在此背景下以黑果腺肋花楸果粉为主要原料，通过在制备工艺中添加花色苷纯品提高花色苷含量，采用响应面优化法探究咀嚼片制备的最佳工艺，并对其咀嚼性、硬度等进行测定，为咀嚼片的制备提供较为直观可靠的参考依据。此外，对其抗氧化性进行了研究，此制备工艺可增加花楸产品的创新性和多样性，为花楸产业的发展开阔思路。
1.1 主要材料与试剂
黑果腺肋花楸冻果（种植于辽宁省海城市，2019年9月上旬采收）；
β-环糊精、淀粉、甘露醇、柠檬酸（食品级，浙江一诺生物科技有限公司）；
1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2, 2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS，纯度98%，上海源叶生物科技有限公司）；
维生素C咀嚼片（含20% VC，浙江康恩贝科技有限公司）；
HP-20大孔吸附树脂（上海昕沪实验设备有限公司）。
1.2 主要仪器与设备
质构仪（Brookfielb CT3，上海茂默科学技术有限公司）；
EYELA真空冷冻干燥机（FDU-1200，北京五洲东方科技发展有限公司）；
数控超声波清洗器（KQ5200DB，昆山市超声仪器有限公司）；
可见分光光度计（V-5100，武汉高精密科学仪器有限公司）；
多冲压片机（MYP-9，广州市扬鹰医疗器械有限公司）；
超微粉碎机（RS-FS1401，合肥荣事达小家电有限公司）；
旋转蒸发仪（N1100，上海爱朗仪器有限公司）；
pH示差计（FE28-Standard，梅特勒托利多科技有限公司）。
1.3 试验条件
1.3.1 黑果腺肋花楸果粉的制备
将黑果腺肋花楸冻果洗净，去除坏果与果梗，于-20 ℃冷冻过夜，于真空冷冻干燥机冻干，超微粉碎机制粉，过0.150 mm（100目）孔径筛，备用。
1.3.2 黑果腺肋花楸花色苷的制备
参考文献[8-10]的方法制备花色苷。取适量花楸，提取溶剂为40%乙醇（含0.5%柠檬酸），按照料液比1∶10（g/mL）、提取温度43 ℃，超声功率200 W辅助提取23 min。抽滤后，于45 ℃旋转蒸发浓缩。利用HP-20大孔吸附树脂进行纯化，冻干后，得纯化后花色苷样品，备用。
1.3.3 黑果腺肋花楸花色苷咀嚼片制备工艺
参考刘魁等[11]的制备方法。黑果腺肋花楸冻干后，超微粉碎，过0.150 mm（100目）孔径筛。按比例称取果粉与各种原料，混合均匀后制片，制片过程中根据情况补加润湿剂。
1.3.4 花色苷含量的测定
采用pH示差法测定黑果腺肋花楸花色苷含量[12]，用分光光度计测定A510nm和A700nm，花色苷含量（g/100 g）计算见式（1）。
式中：ΔA=（A510nm-A700nm）pH 1.0-（A510nm-A700nm）pH 4.5；
V为样品体积，mL；
F为稀释倍数；
Eav为平均消光系数，98.20；
m为样品质量，g。
1.3.5 性能判定
参考李刚凤等[13]压片工艺评分标准，以外观、口感质地、相对片剂标准偏差、风味为评价指标进行评分，评分标准见表1。
表1 评分标准
1.3.6 单因素试验
配方固定花色苷含量20%、微粉硅胶0.5%、乙醇体积分数75%，以果粉、甘露醇、β-环糊精和柠檬酸的添加量为考察因素，通过调整各因素比例，以淀粉填充至100%，探究不同因素对咀嚼片感官评分的影响。固定果粉30%、甘露醇10%、β-环糊精10%、柠檬酸2%，分别考察果粉（2 0%，2 5%，3 0%，35%和40%）、β-环糊精（5%，10%，15%，20%和25%）、甘露醇（5%，10%，15%，20%和25%）和柠檬酸（1%，2%，3%，4%和5%）对感官评分的影响。
1.3.7 响应面优化
采用SPSS软件对单因素试验结果进行分析，选出3个对压片评分影响显著的因素——花楸果粉添加量（X1）、β-环糊精添加量（X2）和甘露醇添加量（X3）。每个变量分别以-1，0和1进行编码，因素和水平见表2。采用Design-Expert对试验数据进行回归分析。
表2 响应面试验因素水平设计 单位：%
1.3.8 质构性质测定
采用质构仪对咀嚼片的性能进行测定，测试条件：样品高度7 mm，检测速度60 mm/min，起始力0.1 N，形变量25%，间隔时间1 s。同时以市面上的VC咀嚼片为对照。
1.3.9 抗氧化活性研究
分别取1片VC片和1片花色苷压片，碾碎，待测。将粉末用无水乙醇配制成10，20，30，40和50 μg/mL，实际VC与花色苷质量浓度约为2，4，6，8和10 μg/mL，同时配制相同质量浓度的花色苷溶液。采用朱璐等[14]的方法测定DPPH自由基清除率；
采用黄彪等[15]的方法测定ABTS自由基清除率；
重复3次取平均值，按式（2）计算清除率。
式中：A0为空白液代替样液的吸光度；
A1为样液与自由基溶液的吸光度；
A2为空白液代替自由基溶液的吸光度。
1.4 数据处理
采用IBM SPSS 21对单因素试验结果进行显著性分析，采用Design Expert 8.0进行响应面设计，试验数据使用Origin软件绘制统计图。
2.1 花色苷提取与纯化
前期研究中根据HPLC-MS分析得到，黑果腺肋花楸花色苷主要含有3种单体，分别为矢车菊素半乳糖苷、矢车菊素-3-阿拉伯糖苷和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷，每种单体在花色苷样品中所占比例分别为47.31%，20.04%和10.80%，共占花色苷样品的78.15%，表明黑果腺肋花楸花色苷经纯化后的纯度很高。
2.2 单因素试验
2.2.1 果粉
黑果腺肋花楸中含有单宁等物质，果实酸涩，因此果粉添加量对片剂的感官品质具有十分重要的影响，过多的果粉会使片剂酸涩难食，而果粉过少会减弱黑果腺肋花楸特有的果香。由图1可以看出，果粉添加量在35%左右出现峰值，在保证口感的同时，还能够体现花楸果实特有果香，统计学分析显示该因素对感官评分具有显著影响（P＜0.05）。
图1 果粉对感官评分的影响
2.2.2β-环糊精
花色苷稳定性差，而β-环糊精是一种很好的药物包合材料，可以提高药物的稳定性，还可以改善药物的溶解度、溶出速率和生物利用度[16]。由图2看出，随着β-环糊精添加量的增加，感官评分逐渐升高，并在10%时出现峰值，随着添加量继续增加，片剂过硬，且过量白色的β-环糊精与深紫色的果粉混合后，颜色发灰，色泽暗淡。可见β-环糊精添加量对片剂也有重要影响，且统计学分析显示该因素对评分影响显著（P＜0.05）。
图2 β-环糊精对感官评分的影响
2.2.3 甘露醇
甘露醇溶解时吸热，有甜味，对口腔有舒服感，十分适用口中清凉剂等咀嚼片的制造[17]。由图3可知，甘露醇添加量的增加，可以提高片剂的评分，10%时达到峰值，随着添加量继续增加，甘露醇的甜味掩盖果粉的香味，不具特色。可见甘露醇添加量也是一个重要的影响因素。统计学分析显示该因素具有显著影响（P＜0.05）。
图3 甘露醇对感官评分的影响
2.2.4 柠檬酸
柠檬酸具有温和爽快的酸味，非常适合掩盖黑果腺肋花楸果粉的涩味[18]。由图4可以看出，柠檬酸的添加确实提高了压片的风味评分，受到一致好评，但因个人对酸度的耐受性差异，使得该因素对感官评分并无显著影响（P＞0.05），添加量3%左右的酸度较为适宜，因此后续试验采用3%柠檬酸添加量。
图4 柠檬酸对感官评分的影响
2.3 响应面优化试验
2.3.1 响应面结果与分析
根据单因素试验结果，以果粉添加量（A）、β-环糊精添加量（B）、甘露醇添加量（C）为自变量，感官评分（Y）为因变量做响应面试验。试验设计及结果见表3。对表3试验数据进行多元回归拟合，果粉添加量（A）、β-环糊精添加量（B）和甘露醇添加量（C）与感官评分（Y）的二次多项回归模型编码方程为Y=96.76-6.26A+10.09B+3.08C-3.97AB+3.50AC-3.60BC-14.09A2-17.64B2-5.32C2。
表3 响应面试验结果表
从表4可以看出，各因素一次项和交互项均达到显著水平（P＜0.05）。这表明，试验因子对响应值并不是简单的线性关系，二次项与交互项都对响应值有很大影响。
表4 独立变量响应面模型方差分析
判定系数R2=0.984 6，R2越接近1，表明该模型拟合程度越好，也越能预测其响应值。同时，失拟项为0.173 6＞0.05，失拟项不显著，说明方程拟合充分，回归方程极显著（P＜0.01）。因此，可用上述回归方程描述各因子与响应值的关系，对不同条件下片剂的感官评分进行预测。
根据回归方程作出不同因子的响应面分析图，结果见图5～图7。三维图坡度较大，说明响应值对这些交互因素的改变越敏感。图5～图7的等高线图呈椭圆形表明其交互作用显著，这与表4分析结果一致。
图5 果粉添加量与环糊精添加量对感官评分影响的响应面图及等高线图
图6 环糊精添加量与甘露醇添加量对感官评分影响的响应面图及等高线图
图7 果粉添加量与甘露醇添加量对感官评分影响的响应面图及等高线图
2.3.2 验证试验
通过Design-Expert 8.0软件得到黑果腺肋花楸花色苷咀嚼片的最佳制备条件：果粉添加量33.74%、β-环糊精添加量11.49%、甘露醇添加量15.52%。在此工艺下黑果腺肋花楸花色苷咀嚼片的感官评分理论值为99.24分。根据实际操作的可行性，调整为果粉添加量34%、β-环糊精添加量11%、甘露醇添加量16%。按照此条件制备咀嚼片，3次平行试验取平均值，感官评分为97.33分，与理论值接近，这就说明响应面优化的结果具有可信度。
2.4 花色苷含量测定
采用pH示差法测定每片中花色苷含量，结果为44.04±7.57 mg。花色苷推荐摄入量为50 mg/d。成人花色苷抗氧化保健功能有效成分的日服用剂量为140～ 160 mg[19]。因此每日服用1片，可保证每日花青素摄入量，满足人体的基本需求。每日服用3～4片，可以起到抗氧化功效，可以对疾病起到预防和改善的功效。
2.5 质构性质测定
硬度是最直接反映口感的一项指标，在质地剖面分析中，直接影响咀嚼性。由表5可以看出，花色苷咀嚼片硬度1与VC咀嚼片无显著差异，硬度较为适中，但第二次下压花色苷咀嚼片硬度明显下降，二者差异显著，进一步结合二者的弹性相比较，从表5可以看出花色苷咀嚼片的弹性显著高于VC咀嚼片，花色苷咀嚼片偏韧性强，VC咀嚼片偏脆硬，且二者的咀嚼性无显著差异，黏性较小，不易粘牙，通过咀嚼性、硬度等指标数据化，对于片剂的性质判定更加直观。
表5 性能测试表（x±S，n=10）
2.6 抗氧化性测定
2.6.1 DPPH自由基清除率
DPPH是一种比较稳定的脂性自由基，呈紫色，加入抗氧化剂以后，紫色褪去，其褪色程度与其接受的电子数呈定量关系[20]。由图8可以看出，质量浓度小于6 μg/mL时，VC咀嚼片的清除率高于花色苷咀嚼片和花色苷，大于6 μg/mL时，花色苷清除率较高，在10 μg/mL时，花色苷咀嚼片的抗氧化性显著高于VC咀嚼片，表明花色苷咀嚼片具有较好的抗氧化性。
图8 不同质量浓度下三种抗氧化剂对DPPH自由基清除率的影响
2.6.2 ABTS自由基清除率
ABTS法是一种被广泛用于检测物质体外抗氧化能力的方法[21]。由图9可以看出，VC清除ABTS自由基的能力较差，花色苷与花色苷咀嚼片的清除ABTS自由基的能力显著高于VC咀嚼片（P＜0.05），花色苷咀嚼片与花色苷的清除ABTS自由基的能力相比，随着质量浓度增大，二者无显著差异（P＞0.05），表明辅料的添加和制剂过程并不影响花色苷的抗氧化性。
图9 在不同质量浓度下三种抗氧化剂ABTS自由基清除率的对比
以黑果腺肋花楸果粉为主料，制备黑果腺肋花楸花色苷咀嚼片，其最佳配方为果粉34%、β-环糊精11%、甘露醇16%、柠檬酸3%、花色苷20%，在此工艺条件下咀嚼片具有较好的口感。并通过质构仪对最佳工艺下的咀嚼片进行测定，与市面上的VC咀嚼片作为对照，结果显示其具有较为适宜的硬度和咀嚼性。此外，对其抗氧化性进行研究，其抗氧化性优于同样高浓度的VC咀嚼片，略低于花色苷，表明其具有较好的抗氧化性能。
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