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罗丽平，李冰晶，赵景芳，杨玲，陆刚
贵州省生物研究所（贵阳 550009）
红托竹荪（Dictyophora rubrovalvata）隶属鬼笔目（Phallales）鬼笔科（Phallaceae）竹荪属（Dictyophora），是一种担子菌（Eumycota）。主生长于竹林下腐殖土[1]，主要分布于我国贵州、云南、四川等省[2]，因菌托部分为紫红色故而得名红托竹荪，又称竹荪。红托竹荪的子实体包括菌盖、菌柄、菌裙、菌托4个部分，总高约20 cm，最高的可达30 cm，菌盖、菌柄、菌裙均为食用部分[3]，菌托为副产物。
对于红托竹荪的研究主要集中在栽培技术的研究上，有研究表明竹荪主要食用部分提取的多糖具有治疗慢性气管炎、增强免疫力[3]、降血糖（压）[4]、减少血液中的胆固醇含量等作用[5-6]，而对于竹荪菌托多糖的研究报道相对较少。吴雪艳等[7]利用水提法提取竹荪菌托多糖，考察温度、时间、料液比、提取次数对多糖提取率的影响并用响应面法建立数学模型，试验结果证明方法具有可行性，可用于实际生产；
林陈强等[8]在提取料液比1∶30（g/mL）、温度90 ℃、时间3 h条件下提取竹荪菌托多糖，多糖提取率为1.356%；
赵凯等[9]采用热水浸提法提取得到菌托多糖，并对其进行体外抗肿瘤研究，结果表明竹荪菌托多糖对小鼠S180肉瘤具有一定的抑制作用；
张轶博等[10]将竹荪菌托多糖作为沙琪玛制作的糖浆配料。
竹荪为贵州省特色食用菌之一，因乡村振兴贵州助推产业扶贫需要，近年来竹荪种植规模迅速扩增。竹荪产量增加的同时副产物菌托产量也增加，菌托的处理均是丢弃，这不仅造成环境的污染，而且因菌托中的有效成分没有得到合理利用从而造成资源浪费。为充分利用有效资源，项目组前期对竹荪菌托多糖的抗氧化作用进行研究[11]，并对相关护肤品进行研发，产品试用得到一致好评。但其中所含色素影响产品的色泽，以及蛋白质含量严重影响产品功效。因此，试验对菌托多糖进行纯化研究，主要是针对改善所研发产品的色泽、质地和提高相应功效，最终提高加工产品价值。
1.1 材料与设备
1.1.1 材料与试剂
竹荪菌托（汇苑特色农业有限公司）；
胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、姜黄素标准品（上海叶源生物科技有限公司）；
活性炭（重庆茂业化学试剂有限公司）；
无水乙醇、浓硫酸、磷酸、苯酚、考马斯亮蓝G250（均为分析纯，重庆川东化工有限公司）；
试验用水（娃哈哈纯净水）。
1.1.2 仪器与设备
101-2AB型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；
DZ-2BCIV真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；
TG-15离心机（四川蜀科仪器有限公司）；
HH-M8电热恒温水浴锅（金坛区金城春兰实验仪器厂）；
ISO9001型电子天平（北京赛多丽斯仪器系统有限公司）；
KQ-800DE超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；
LGJ-18真空冷冻干燥箱（北京松源华兴科技发展公司）；
HP-845紫外可见分光光度计（上海精科实业有限公司）；
HPLC Agilent 1260（美国Agilent公司）。
1.2 方法
1.2.1 样品的制备
将新鲜竹荪菌托洗净，晾干水分，用75%乙醇浸泡24 h，过滤并挥尽乙醇，将菌托置于烘箱中50 ℃烘干粉碎。称取一定量菌托粉末于烧瓶中，以水为溶剂，沸水浴回流提取，提取2次，每次2 h。经纱布过滤，在4 ℃以10 000 r/min离心，合并上清液，于50 ℃减压浓缩至浸膏，用85%乙醇处理，于4 ℃静置过夜，过滤浓缩上清回收溶剂，收集沉淀，挥发尽乙醇后置于真空干燥箱中45 ℃烘干，得到竹荪菌托多糖提取物（菌托多糖）。
1.3 单因素试验
脱色试验考察吸附剂不同固料比、吸附时间、吸附温度对竹荪多糖中色素脱除率的影响；
脱蛋白试验考察木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、复合酶（木瓜蛋白酶和胰蛋白酶1∶1混合）、酶用量、酶解时间、酶解温度对竹荪多糖中蛋白质脱除率的影响。通过计算菌托多糖含量、色素和蛋白质的脱除率确定最佳因素条件。
1.3.1 脱色试验方案设计
1.3.1.1 固料比的筛选
配制质量浓度5 mg/mL的样品水溶液，等体积分组，静态吸附1 h，37 ℃条件下，分别考察固料比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60和1∶70 g/mL）对竹荪多糖中色素脱除率的影响。
1.3.1.2 吸附时间的筛选
配制质量浓度5 mg/mL的样品溶液，等体积分为组，37 ℃条件下，固料比1∶50（g/mL），分别考察静态吸附时间（0.5，1.0，2.0，3.0和4.0 h）对竹荪多糖中色素脱除率的影响。
1.3.1.3 吸附温度的筛选
配制质量浓度5 mg/mL的样品溶液，等体积分组，静态吸附时间2 h，固料比1∶50（g/mL），考察吸附温度（20，40，60，80和100 ℃）对竹荪多糖中色素脱除率的影响。
1.3.1.4 正交试验优化脱色工艺
在各单因素试验的基础上，分别选择吸附剂固料比、吸附时间和吸附温度为因素自变量，以菌托多糖含量、色素脱除率为考察指标，因素水平设计见表1。
表1 活性炭脱色正交试验因素水平表
1.3.2 脱蛋白试验方案设计
1.3.2.1 酶种类的筛选
将质量浓度5 mg/mL的样品溶液，等体积分组，样品溶液体积均为100 mL，考察木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、复合酶在用量均为10 mg，温度为37 ℃条件下，酶解1 h时各酶对菌托多糖中蛋白质脱除率的影响。
1.3.2.2 酶用量的筛选
将质量浓度5 mg/mL的样品溶液，等体积分组，在37 ℃条件下酶解1 h，考察木瓜蛋白酶用量（5，10，15，20，25和30 mg）对菌托多糖中蛋白质脱除率的影响。
1.3.2.3 酶解时间的筛选
将质量浓度5 mg/mL的样品溶液，等体积分组，在37 ℃条件下，木瓜蛋白酶用量10 mg，考察酶解时间（0.5，1.0，2.0，3.0和4.0 h）对菌托多糖中蛋白质脱除率的影响。
1.3.2.4 酶解温度的筛选
将质量浓度5 mg/mL的样品溶液，等体积分组，木瓜蛋白酶用量10 mg，酶解时间2 h，考察酶解温度（20，40，60，80和100 ℃）对菌托多糖中蛋白质脱除率的影响。
1.3.2.5 正交试验优化脱蛋白工艺
在已考察各单因素试验结果的基础上，分别选择木瓜蛋白酶用量、酶解时间及酶解温度为自变量，以菌托多糖含量、蛋白质脱除率为考察指标，因素水平设计表2。
表2 脱蛋白正交试验因素水平表
1.3.3 测定项目与方法
1.3.3.1 多糖含量
采用苯酚硫酸法[12]测定样品中多糖的含量。葡萄糖标准曲线的制作：配制0.1 mg/mL的葡萄糖溶液，取相应体积分别配制质量浓度为0.005，0.015，0.025，0.035和0.045 mg/mL的溶液，取1 mL样品加入6%苯酚1 mL，缓慢加入5 mL浓硫酸反应，摇匀冷却后在490 nm下测定吸光度（A），以质量浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线并得到回归方程y=8.829x+0.014 4，R2=0.999。
1.3.3.2 蛋白质含量
使用的考马斯亮蓝G-250法[13]测定样品中的蛋白质含量。蛋白质标准曲线的制作：配制2 mg/mL牛血清蛋白溶液，取相应体积分别配制质量浓度为0.05，0.10，0.15，0.20和0.25 mg/mL的溶液，取1 mL样品于试管中并加入5 mL的考马斯亮蓝G250溶液，摇匀静置反应5 min后在595 nm处测定吸光度A。以质量浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制蛋白质标准曲线并得到回归方程y=3.816 2x+0.166 3，R2=0.999 4。
1.3.3.3 色素种类及含量
采用高效液相色谱法（HPLC）对比确定样品中的主要色素种类，采用紫外分光光度法[14]测定样品中的色素含量。取配制好的样品溶液，在紫外分光光度计中进行光度（200～700 nm）扫描，得到最大吸收波长。经高效液相色谱法（HPLC）比对，确定竹荪菌托中主要色素为姜黄素（图1）。
图1 竹荪菌托中色素HPLC图谱
以蒸馏水作为空白参比，用紫外分光光度法测定被试样品的消光值和吸光度，带入色素计算公式[16]计算相应色素含量。
式中：E1%1cm425 nm为所测样品吸光度；
1 607为姜黄素纯品的吸光度；
A为样品溶液的消光值；
C为样品浓度。
1.3.4 数据处理
采用SPSS 17.0软件对试验数据进行方差和显著性分析。
2.1 脱色试验
2.1.1 固料比的确定
由图2可知，固定吸附时间1 h、吸附温度60 ℃，固料比1∶50（g/mL）时菌托多糖含量开始缓慢下降而脱色率仍在上升，综合脱色后菌托多糖含量和脱色率结果，选择固料比1∶50（g/mL）为宜。
图2 固料比对菌托多糖脱色效果的影响
2.1.2 吸附时间的确定
由图3可知，固定固料比1∶50（g/mL）、吸附温度60 ℃，吸附时间0～1 h时菌托多糖含量下降较明显，色素脱除率显著升高，吸附时间2 h时，菌托多糖含量和色素脱除率均较缓慢，吸附时间高于3 h时，菌托多糖含量下降较明显，色素脱出率仍较缓慢，因此吸附时间选择2～3 h为宜。
图3 吸附时间对菌托多糖脱色效果的影响
2.1.3 吸附温度的确定
由图4可知，固定固料比1∶50（g/mL）、吸附时间1 h，温度由室温（15 ℃）升至20 ℃时菌托多糖含量下降较为明显，而色素脱率显著升高，温度在20～ 60 ℃时多糖含量和脱色率变化较小，温度高于80 ℃时菌托多糖含量下降较明显，色素脱出率仍在缓慢上升。综合脱色后菌托多糖的含量和脱色率结果，选择吸附温度60 ℃较合适。
图4 吸附温度对菌托多糖脱色效果的影响
2.1.4 脱色正交试验结果
由表3中R值可知：影响菌托多糖含量因素主次顺序为C＞B＞A，影响脱色率的主次因素B＞A＞C。由表4方差分析结果可知，以菌托多糖的含量为评价指标，吸附温度对菌托多糖在脱色中含量的影响显著（P＜0.05）。以色素脱出率为评价指标，活性炭用量和吸附时间对竹荪菌托多糖脱色率影响显著（P＜ 0.05）。根据正交试验结果可知：综合脱色后菌托多糖含量和脱色率结果，最优脱色组合为A1B3C3，即固料比1∶50（g/mL）、吸附时间2.5 h、吸附温度60 ℃。
表3 L9(33)脱色正交试验结果
表4 活性炭脱色正交试验结果分差分析
2.2 脱蛋白试验
2.2.1 酶种类的确定
由图5可知，固定酶解时间1 h、酶解温度45 ℃、沸水灭活10 min，木瓜蛋白酶对提取物的蛋白质脱除率优于其他2种酶，且多糖含量也有所提高。因此选择木瓜蛋白酶为目标酶。
图5 不同酶对菌托多糖脱蛋白效果的影响
2.2.2 酶用量的确定
由图6可知：固定酶解时间1 h、酶解温度45 ℃、沸水灭活10 min，随着酶用量的增加，多糖含量逐渐增加，但幅度较小，蛋白质含量在酶用量0～5 mg时下降较显著，随后随着酶用量的增加下降幅度较小，根据试验结果选取酶用量10～30 mg为宜。
图6 酶用量对菌托多糖脱蛋白效果的影响
2.2.3 酶解时间的确定
由图7可知：在固定酶用量10 mg、酶解温度45 ℃、沸水灭活10 min条件下，酶解时间0～2 h时多糖含量升高较明显，蛋白质含量下降也较明显，酶解时间达到2 h时，多糖含量达到最高，酶解时间继续延长至3 h时，多糖含量升高不明显而蛋白质含量与2 h时基本不变，因此选择酶解时间1～2 h为宜。
图7 酶解时间对菌托多糖脱蛋白效果的影响
2.2.4 酶解温度的确定
由图8可知，固定酶用量10 mg、酶解时间2 h、沸水灭活10 min，酶解温度50 ℃时酶对菌托提取物蛋白质较好，温度继续升高时，多糖含量不再升高且有下降趋势，蛋白质脱除率变化不明显。因此酶解温度不高于60 ℃为宜。
图8 酶解温度对菌托多糖脱蛋白效果的影响
2.2.5 脱蛋白正交试验结果
由表5中R值可知，影响菌托多糖含量的主次因素D＞E＞F，影响菌托多糖脱蛋白因素主次顺序为E＞F＞D。由表6方差分析结果可知：以菌托多糖含量为评价指标，酶解时间对竹荪菌托多糖在进行脱蛋白中多糖的含量影响显著（P＜0.05）；
以蛋白质脱除率为评价指标，酶用量对菌托多糖在进行脱蛋白时蛋白质的脱除率影响显著（P＜0.05）。根据正交试验结果可知，综合脱色后菌托多糖的含量和蛋白质脱除率结果，最优的脱蛋白组合为D3E1F3，即酶用量30 mg、酶解时间1 h、酶解温度60 ℃。
表5 L9(33)木瓜蛋白酶脱蛋白正交试验结果
表6 木瓜蛋白酶脱蛋白正交试验结果分差分析
研究结果表明：吸附剂用量、吸附时间和吸附温度均显著影响菌托多糖的色素脱除率，经菌托多糖脱色研究得出最优脱色工艺为固料比1∶40（g/mL）、吸附时间2.5 h、吸附温度60 ℃。酶解时间、酶解温度、酶用量均能影响菌托多糖中蛋白质的脱除率，其中酶解时间对蛋白质的脱除率影响显著。经菌托多糖脱蛋白研究得出最优脱蛋白工艺：酶用量30 mg、酶解时间1 h、酶解温度60 ℃。在上述条件下菌托多糖色素脱除率可达67.83%，多糖含量由原来的27.77%提高到49.07%，蛋白质含量由原来的12.87%下降到6.33%。此研究不仅变废为宝且成本低廉，具有广阔的开发利用前景。
研究结果显示所选三个因素对菌托多糖含量和色素脱除率的影响一致，活性炭用量逐渐增加、吸附时间变长、吸附温度升高均会导致多糖含量的下降，原因可能是用量和吸附时间的增加使得多糖分子进入活性炭空隙概率增大，从而导致多糖含量降低，吸附温度升高可能是增加糖分子运动，使得更多糖分子进入到活性炭的空隙中，从而导致多糖含量的降低。在进行酶解温度考察时，当温度在80 ℃时多糖含量下降较为明显；
在酶解时间3 h和4 h时多糖含量上升幅度较小。可能的原因是：随着酶解温度继续升高和酶解时间变长，酶的活性逐渐降低，因为酶本质是蛋白质，失活后的酶附在糖分子的表面，导致糖含量的降低。
随着人工驯化技术的不断提高，食用菌产业规模增长也越来越迅速，食用菌产出量也越来越大，因此所产生的食用菌废弃物也越来越多，此研究对竹荪高附加值产品的开发提供研究基础，有助于延长竹荪产业链。菌托中所含的其他活性成分和更多生物活性需要进一步研究。
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