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方世殊 刘传宏 刘倩 徐悦蓉 骆厚卓 张校晨 金作林
有统计表明，将近88%的正畸患者在无托槽隐形矫治治疗期间或治疗后要求进行牙齿美白[1-2]。
Davis、 Krug等[3-4]曾尝试在固定矫治中加入漂白治疗，治疗效果与常规漂白治疗相比无明显差异。由于牙齿漂白的原理是通过过氧化物与牙齿内色素分子发生氧化进而消除色素沉积，单次漂白治疗后过氧化物会降解而无法实现长期牙齿美白[5]。且接受隐形矫治的患者若进行牙齿漂白治疗需频繁地摘除隐形矫治器，不利于最终矫治效果[6]。因此，研发一种在矫治过程中能够长效缓释过氧化氢的多功能隐形矫治器具有广阔的研究前景。目前隐形矫治器大多由热压膜材料加工制成，合成能够缓释过氧化氢的新型热压膜材料是制备多功能隐形矫治器的基础[7]。本研究首先研发了可以装载在热压膜材料表面的缓释过氧化氢凝胶，将其装载于制备隐形矫治器的热压膜材料上合成新型热压膜材料。通过检测新型材料的过氧化氢缓释效果，对比其与普通热压膜材料在力学性能、光学性能及细胞毒性作用方面的差异，评价其是否能够作为美白型隐形矫治器的基体材料。
1.1 主要试剂及仪器
试剂：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，分析纯)、硅酸四乙酯(TEOS)、SPLINT膜片(圆形，厚度0.8 mm，直径120±1 mm)、海藻酸钠(Alg)、多巴胺盐酸盐(DA·HCL)、氨水(分析纯)、氯化钙(分析纯)、CCK-8试剂盒(上海碧云天生物)、人牙龈成纤维细胞系(YS1813C，上海雅吉生物)等。
仪器：磁力加热搅拌器(泊头市科析仪器有限公司)；
马弗炉(GW1200，北京雅格隆科技)、鼓风干燥箱(DHG-9030，广州宏展科技)；
恒温水浴箱、超声清洗器、酶标仪(BioTek，美国)；
倒置显微镜(CKX53，OLYMPUS，日本)。
1.2 装载缓释凝胶的热压膜材料制备
用CTAB模板法及碱催化溶胶-凝胶法制备介孔二氧化硅纳米粒子。将制得的介孔二氧化硅纳米粒子与一定量的多巴胺和海藻酸钠混合，通过多巴胺的界面聚合及海藻酸钠的离子交联反应在热压膜材料表面构建稳定的互穿网络凝胶，将大量介孔二氧化硅纳米粒子束缚在凝胶内部，制备完成装载缓释凝胶的热压膜材料。新型材料置于4 ℃保存，浸润过氧化氢的材料用于过氧化氢浓度检测、透光性能测试及力学性能测试，未浸润过氧化氢的材料用于细胞毒性检测。
1.3 过氧化氢浓度检测
采用过氧化氢测定试剂盒(南京凯基生物,KGT018)检测浸提液中过氧化氢浓度。按照说明书测定空白管、标准管及测定管在405 nm处的吸光度，根据公式：样本H2O2含量(mmol/L)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准品浓度( 163 mmol/L), 计算出样本的过氧化氢浓度并绘制浓度-浸泡时间曲线。
1.4 热压膜材料标准试样的制备
按照ASTM D638标准制备用于检测的标准试样。通过仪器切割并制备符合该要求的试样。其中装载过氧化氢缓释凝胶的热压膜材料试样为实验组，普通热压膜材料试样为对照组。
1.5 透光性能测试
透光性能遵循国标GB/T 2410-2008，通过透光率/雾度测定仪对热压膜片试样进行测定。
1.6 力学性能测试
在常温条件下，拉伸速率设定为5 mm/min，通过万能材料试验机检测实验组、对照组热压膜片试样的最大力、拉伸强度、弹性模量、拉伸屈服应力、拉伸屈服应变及断裂伸长率。
1.7 细胞毒性检测
体外培养人牙龈成纤维细胞，分别用未浸润过氧化氢新型材料的培养基浸提液、普通材料的培养基浸提液处理细胞。于培养第0、 2、 4、 6、 8和10 天进行CCK-8检测。以“处理组A值/空白对照组A值”的比值结果作为细胞存活率的评价指标。
1.8 统计学处理
2.1 实验组材料过氧化氢缓释效果评价
实验组材料浸泡于人工唾液中，前3 d每12 h检测一次浸提液中过氧化氢浓度，后续每1 d检测1 次并制作浓度曲线。结果表明实验组材料浸提液中过氧化氢浓度会缓慢增加，表明装载凝胶的实验组材料能实现过氧化氢缓释效果(图 1)。
图 1 实验组材料浸提液中过氧化氢浓度曲线
2.2 实验组与对照组材料力学性能比较
力学性能检测结果表明实验组材料装载缓释凝胶后厚度仅增加0.01 mm。相比于对照组材料，实验组材料弹性模量增加(P<0.05)，拉伸强度和断裂伸长率减小(P<0.05)，而拉伸屈服应力和拉伸屈服应变无明显差异(P>0.05)(表 1)。
表 1 实验组与对照组材料力学性能对比
2.3 实验组与对照组材料透光性能比较
透光性能检测结果表明相比于对照组材料，实验组材料的透光率较低，而雾度较高(P<0.05)。但附加凝胶的实验组材料透光率仍大于82%，具有良好的透明度(图 2)。
图 2 2 组材料的透光性能比较
2.4 实验组与对照组材料细胞毒性比较
通过CCK-8检测实验组与对照组材料浸提液对人牙龈成纤维细胞生长情况的影响。结果表明实验组材料对人牙龈成纤维细胞的增殖影响与对照组材料无明显差异(P>0.05)，且细胞10 d内的成活率均大于90%(图 3)。
图 3 2 组材料的细胞毒性比较
隐形矫治器的材料兼具有一定的弹性和刚性，需要长时间佩戴在口内。这种材料如果可以缓释药物，对一些需要长期释药的治疗中是一种很好的药物载体。前期研究发现，佩戴牙导致牙齿变色，同时越来越多的隐形矫治器患者，在佩戴牙套中提出对牙齿美白的需求。变色、外源性染色和牙齿漂白是临床上常用的变色牙体治疗方法，一般分为诊室漂白，家庭漂白等，漂白过程可配合或不配合冷光照射[8]。不论是诊室外漂白还是诊室内漂白，过氧化物都是关键[9]。过氧化氢和过氧化脲是最常用的两种牙齿漂白剂，美白牙贴、托盘漂白术等均是利用这类过氧化物实现短期牙齿漂白作用[10]。但高浓度的过氧化物会对牙齿表面结构造成损伤，带来牙齿敏感、牙龈炎症等漂白副作用，因此单次使用剂量往往较小，持续漂白时间较短[11-12]。有研究报导，隐形矫治器可作为漂白凝胶的载体，并取得了一定的治疗效果，但是就家庭漂白所使用的凝胶而言，需要患者自行涂抹于矫治器或漂白牙托内，用量及用法无法精确控制，且漂白所用的过氧化物凝胶具有流动性，在使用过程中可能与牙龈组织接触甚至流入口腔内随吞咽进入消化系统，为患者带来了安全隐患[13]。因此，设计能够缓释过氧化物的隐形矫治器对于解决这一系列问题具有重要意义，而研发对应的新型热压膜材料则是关键的第一步。
热压膜材料是目前隐形矫治器最常用的制备材料[6]。一般符合制备隐形矫治器条件的热压膜材料需要具有良好的透明性、合适的力学性能、较低的唾液吸收率及良好的生物相容性[14-15]。隐形矫治器的高透明性能保证患者佩戴矫治过程中不影响整体口腔美观，这就要求制作隐形矫治器的热压膜材料的透明性高于80%，雾度低于10%[16]。相比于传统矫治器，隐形矫治器对患者牙齿的矫治力主要取决于材料变形后的回弹力[17]。回弹力在材料测试试验中往往以弹性模量作为计算指标，弹性模量越大，则说明材料产生形变后的回弹力越大，对牙齿的矫治能力越强，越有利于保障患者按预期计划进行逐步矫正[18]。同时，出于对口腔安全性的考虑，隐形矫治器的材料硬度、脆性适中[19]。这就要求隐形矫治器的材料具有一定的拉伸强度和断裂伸长率，但不应过高，防止在佩戴、摘除过程中因短期剧烈形变而断裂，造成患者口腔损伤[20]。由于隐形矫治器长期处于口腔唾液环境中，且会与牙龈、口腔粘膜等直接接触，矫治器本身会受到唾液中成份的影响，也会对佩戴者口腔内接触部位产生长期影响[21]。因此，制备矫治器的热压膜材料需具有良好的生物相容性，尤其是较低的细胞毒性[22]。
本研究通过CTAB模板法及碱催化溶胶-凝胶法制备介孔二氧化硅纳米粒子，将其与多巴胺、海藻酸钠混合制备成能吸附过氧化氢的凝胶，并装载于热压膜材料上。通过过氧化氢浓度测定表明装载凝胶的热压膜材料能够缓释过氧化氢，其效果至少可维持168 h。且相比于普通热压膜材料，该材料厚度仅增加0.01 mm；
弹性模量增加，说明具有合适的抵抗弹性形变能力；
拉伸强度、断裂伸长率减小，说明具有合适的硬度和脆性；
拉伸屈服应力和拉伸屈服应变无明显变化，说明柔韧度未降低。光学性能方面由于受凝胶层的影响，透光率有所下降，但仍大于80%；
雾度相对提高，但仍小于10%，说明材料的整体透明度良好。细胞毒性检测结果也表明装载凝胶的材料不会影响人牙龈成纤维细胞的增殖。除了装载过氧化氢等美白药物外，介孔二氧化硅由于其表面可功能化修饰、纳米粒子孔径可调控及良好的生物安全性，其在口腔医学领域的应用也逐渐广泛，如作为口腔溃疡、口腔颌面部肿瘤等治疗药物的重要载体[23]。
本研究设计的过氧化氢缓释凝胶不影响热压膜材料的力学性能、透光性能和生物相容性，装载该凝胶的新型热压膜材料符合制备隐形矫治器的材料要求，能用于实现长期美白效果的隐形矫治器的设计，为矫治器的临床效果及应用提供材料基础。
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