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赵序雯 刘伟 张新东 肖智
(济宁医学院附属滕州市中心人民医院，山东 滕州 277599)
肾肿瘤的发病率及死亡率占全身肿瘤的2%左右，其中肾细胞癌可占85%左右，被认为是我国泌尿外科恶性肿瘤中一类非常常见的恶性肿瘤疾病，但在当前临床研究中，关于肾癌的发病机制尚未明确〔1〕。据流行病学专家发现肾癌的发生发展可受到多种因素影响，如吸烟、肥胖、职业、基础疾病、饮酒及家族史等〔2〕。也有报道发现，由于恶性肿瘤的侵袭及转移本身属于一个较为复杂的病理过程，且该过程与细胞外基质、基底膜降解等多种过程及环节有关，且新生血管的形成与肿瘤的发生发展、转移等具有密切关联性〔3〕。在多种促血管生长因子中，表皮生长因子样结构域(EGFL)7被认为是促进血管管腔形成的必需因子，可在血管管腔形成及功能中发挥较为重要的作用；
血管表皮生长因子(VEGF)被认为是最为重要的一种血管生成正性因子，可有效促进调整血管内皮的增殖过程；
而基质金属蛋白酶(MMP)本身作为一种可在恶性肿瘤中呈现出较高表达水平的物质，在恶性肿瘤细胞生长及增殖过程中过度表达〔4,5〕。本文拟分析EGFL7、MMP-9和VEGF在老年肾透明细胞癌中的阳性表达及临床意义。
1.1一般资料 选取济宁医学院附属滕州市中心人民医院2019年4月至2021年4月收治的老年肾透明细胞癌患者80例的临床资料，均签署知情同意书，其中男42例，女38例，年龄60～72岁，平均(65.24±4.12)岁，均接受根治性肾切除术治疗，选取切除下来的肾透明细胞癌组织样本进行研究，全部患者按照TNM分期分为Ⅰ期组(n=14)、Ⅱ期组(n=19)、Ⅲ期组(n=27)、Ⅳ期组(n=20)，同时按照Fuhrman分级分为1级组(n=15)、2级组(n=21)、3级组(n=30)及4级组(n=14)。TNM分期指肿瘤原发灶的情况，随着肿瘤体积的增加和邻近组织受累范围的增加，依次用T1～T4来表示〔6〕。Fuhrman分级的确定方法是用显微镜观察癌细胞，根据癌细胞的核形态做分级，如果异型性越高，分级就越高，预后越差。具体分级方法：Ⅰ级为高分化；
Ⅱ级为高分化；
Ⅲ级为中分化；
Ⅳ级为低分化(未分化)〔7〕。
1.2组织标本选取方法 在手术过程中使用解剖刀在癌肿部位取出300 mg癌组织后，将癌组织放置在标记好的无RNA酶冻存管中保存15 min，随后放置-80℃冰箱中保存待用。
1.3免疫组织化学染色方法 采用免疫组化链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)法测量EGFL7、MMP-9和VEGF。具体操作方法：选择含有肿瘤的组织标本用石蜡切片固定，烤片后，使用二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水；
3%过氧化氢孵育，使用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤以达到阻断内源性过氧化物酶的目的；
使用微波抗原修复，并向其中分别加入正常羊血清及过氧化物酶溶液，孵育后加入一抗4℃孵育过夜，之后加入生物素标记二抗及辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素链霉菌抗生物素溶液，最后给予二氨基联苯胺(DAB)染色，苏木素复染，常规脱水及封片处理。采用PBS代替一抗作为阴性对照组。该实验中所涉及的免疫组化试剂盒及相关试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，主要仪器光学显微镜、电热恒温培养箱、组织超薄切片机购自上海跃进医疗器械厂。
1.4结果判读 EGFL7、MMP-9和VEGF阳性染色将肿瘤细胞胞质内或包膜出现棕黄色颗粒沉着判断为阳性，由两位病理科医生独立完成判断。通过利用高倍镜下半定量法判断每张切片内单个视野内染色阳性细胞百分比，阳性细胞≤10%计为0；
阳性细胞10%～24%计+；
25%～49%计为；
50%～74%计为；
≥75%计为〔8〕。
1.5统计学处理 采用SPSS18.0统计软件进行χ2检验、Spearman等级相关分析。
2.1EGFL7、MMP-9和VEGF在肾透明细胞癌中表达情况 在Fuhrman分级4级的肾透明细胞癌中，EGFL-7在胞质中呈现高表达，尤其在毛细血管形成区域表达较高；
MMP-9在胞质中出现淡黄色或棕色颗粒；
VEGF也在毛细血管周围的肿瘤细胞胞质和胞膜中高表达。见图1。
图1 EGFL7、MMP-9和VEGF在肾透明细胞癌中表达情况(DAB，×100)
2.2不同TNM分期下EGFL7、MMP-9和VEGF阳性率对比 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期组分别与Ⅰ期组相比，EGFL7、MMP-9和VEGF阳性率较高，Ⅲ、Ⅳ期组分别与Ⅱ期组相比阳性率较高，Ⅳ与Ⅲ期组相比阳性率较高(P<0.05)。见表1。
2.3不同Fuhrman分级EGFL7、MMP-9和VEGF阳性率对比 2、3、4级组分别与1级组相比，EGFL7、MMP-9和VEGF阳性率较高，3、4级组分别与2级组相比阳性率较高，4与3级组相比阳性率较高(P<0.05)。见表1。
2.4EGFL7、MMP-9和VEGF阳性率与TNM分期、Fuhrman分级相关性 肾细胞癌中EGFL7、MMP-9和VEGF阳性表达率随着TNM分期(r=0.887、0.657、0.914)、Fuhrman分级(r=0.954、0.687、0.776)的升高而增加，且呈现出了明显的正相关性(P<0.05)。且EGFL7与MMP-9、VEGF呈正相关(r=0.579、0.812，P<0.005)，MMP-9与VEGF呈正相关(r=0.745，P<0.05)。
表1 不同TNM分期及不同Fuhrman分级EGFL7、MMP-9和VEGF阳性率对比〔n(%)〕
报道指出，无论是原发性肿瘤还是继发性转移瘤在正常生长及扩散过程中均会依赖血管的生长及发展，且肿瘤的持续恶化及生长也必须依赖新生血管的生成，方可提供重组的营养及氧气，并由此快速将产物运输，对肿瘤的生长发挥促进作用，同时也为肿瘤细胞进入体内的循环提供基础〔9〕。肿瘤血管生成是一个较为连续且复杂的过程，且肿瘤体内的新生血管是由于各种血管因子诱导及相互作用形成，为此，对肾癌组织中的血管生长因子进行研究具有重要临床意义〔10〕。
VEGF被认为是最强的血管生长因子，在内皮细胞系统内可特异性作用在内皮细胞生长因子受体上，并对内皮细胞的增殖及肿瘤血管的生长可产生较强的刺激作用，且帮助肿瘤脱落后可顺利进入血管内，而对肿瘤的生长、浸润及转移产生一系列推动作用〔11〕。本研究结果说明当VEGF的阳性表达率升高后，可通过作用在内皮细胞的受体上而发挥较为明显的生物学功能，并由此诱导并加重内皮细胞的增殖及迁移，促进肿瘤血管生成〔12〕。
EGFL7作为一种在近年来新发现的新基因，可特异性表达在内皮细胞系统上，研究指出，EGFL7的作用在于能够对血管内皮迁移产生较为显著的促进作用，同时还可对内皮细胞黏附进行有效调节，并能够对帮助构建血管床结构，有效维持血管稳定性〔13〕。另外，有研究显示，由于肿瘤组织中具有较为丰富的血液供应，EGFL7也会大量存在于肿瘤新生血管内皮细胞内〔14〕。本研究结果显示，肾癌中若表现出了EGFL7高表达情况，说明此时肿瘤血管不断形成，EGFL7也有效维持了肿瘤血管的稳定性。
MMPs是一类锌离子和钙离子依赖的蛋白酶家族，该家族中有24种类型，可靶向ECM中众多蛋白并使其降解，且各种MMP间具有一定底物特异性〔15〕。正常情况下，MMPs能够降解细胞外基质和基膜，和组织金属蛋白酶抑制剂一起调控细胞外基质的降解，但调控机制失衡会使细胞外基质过度降解，本身在介导肿瘤血管新生、侵袭及转移过程中可发挥较强作用〔16〕。其中MMP-9被认为是肿瘤发生发展的一类潜在生物标志物，同时也被认为是细胞外基质重塑的关键效应物质。本结果提示，MMP-9的平衡被打破后，肿瘤的生长及血管恶化也会相应进展〔17〕。另外，本研究结果显示，EGFL7、MMP-9和VEGF阳性率三者之间也呈现出了明显的两两正相关性，但相互之间的作用机制尚未明确，推测可能出现此结果的原因是由于EGFL7的高表达可加快肿瘤血管生成及肿瘤体积增大，在肿瘤体积不断增大的期间，对营养的需求量也明显升高，同时需要更多的新生血管为其提供充分养分，此时VEGF等其他促血管生长因子的表达量就会生长，MMP-9的调控机制也会失衡，由此对内皮细胞产生刺激作用而导致其大量增生，加之内皮细胞持续聚集而形成血管芽，旨在维持肿瘤血管的稳定性〔18〕。
综上，老年肾透明细胞癌组织中EGFL7、MMP-9和VEGF与疾病的不同分期及分级之间具有相关性，三者的高阳性表达可能协同了肿瘤新生血管的生成及疾病的恶化进展。
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