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刘 钰，王 星，崔红占，孙涌泉，步纪强，陈子英
(河北医科大学第二医院心脏大血管外科，河北 石家庄 050000)
血管急性损伤后可通过多种因素引起血管重塑，这一病理过程可导致动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)与经皮腔内血管成形术(percutaneous transluminal angioplasty,PTA)后血管再狭窄等多种心血管疾病的发生[1]。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)是构成血管中膜的主要细胞，具有表型转化的可塑性。研究表明，VSMCs在多种内源或外源性的炎症因子刺激下，分泌大量细胞黏附因子、趋化因子等，促使VSMCs增殖、迁移，增强动脉粥样硬化斑块内炎症反应，参与内膜新生，最终导致斑块失稳及最终破裂、管腔狭窄等病理过程的发生[2-6]。胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1，)主要来由回肠的L型内分泌细胞分泌，不仅可以促进胰岛β细胞胰岛素的分泌，而且能够显著抑制α细胞胰高血糖素的分泌，在延迟胃排空的同时抑制餐后血糖升高，发挥显著的降低血糖的功能，临床当中用于治疗2型糖尿病受到良好的治疗效果。利拉鲁肽(liraglutide，LIR)是GLP-1类似物，与天然GLP-1高度同源，因其强大的降糖作用和体重减轻而被广泛用于治疗2型糖尿病[7]。最近的研究表明，LIR可显著降低2型糖尿病患者、非酒精性脂肪性肝病患者血清中的炎性指标水平，并增强抗氧化反应能力，提示LIR可改善患者体内炎症反应[8-9]。然而，LIR对血管炎症，尤其是炎症刺激下VSMCs炎症反应有何作用目前尚未见到相关的报道。本研究采用LIR对TNF-α诱导的VSMCs进行干预，观察其对血管炎症的作用，探讨可能的作用机制。
1.1材料
1.1.1细胞及主要实验试剂 于河北医科大学实验动物中心购买4周龄清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，用贴块法分离获得VSMCs。白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒购自于中国碧云天公司。Trizol、cDNA第一链合成试剂盒、SYBR均购自于美国Invitrogen公司。PCR引物购自于中国上海生工生物工程有限公司。细胞间黏附分子1(inter-cellular adhesion molecule 1,ICAM-1)抗体购自于英国Abcam公司。MCP-1抗体购自于美国Santa公司。GAPDH抗体购自于美国Cell Signaling Technology公司。IκB-α抗体、核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB) p65抗体购自于美国Genetex公司。羊抗兔荧光标记二抗购自于中国艾美捷科技有限公司。肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor-α, TNF-α)购自于美国BD公司。利拉鲁肽购自丹麦诺和诺德公司。
1.1.2实验仪器 细胞培养箱购自于Foma Scientific公司。Nanodrop 1000分光光度计、实时荧光定量PCR(ABI7500)均购自于Thermo公司。涡旋震荡器(Vortex-genie2)购自于Scientific Industries公司。多功能酶标仪购自于Thermo公司。普通PCR仪购、电泳仪、半干式蛋白质印迹转膜槽、化学发光成像分析仪均购自于Bio-Rad公司。激光共聚焦显微镜购自于Leica公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养及分组 4%水合氯醛麻醉后，取胸腹主动脉，用贴块法分离VSMC，加入含10% FBS的DMEM低糖培养基，置于含有5% CO2的37 ℃恒温孵箱中培养，待细胞约长满瓶底80%时，用0.25%的胰酶进行消化传代，取3～5代细胞用于实验。实验分为三组：空白对照NC组，TNF-α组(10 μg/L)和TNF-α+LIR组(10 μg/LTNF-α+ 100 nmol/L LIR)。
1.2.2ELISA检测培养基促炎因子IL-1β和IL-6变化 将细胞培养24 h后，收集细胞培养基，4 ℃，5 000 r/min离心15 min，吸取等量的上清液体。按ELISA检测试剂盒说明说进行IL-1β和IL-6检测。
1.2.3qPCR检测细胞circ-sirt1、ICAM-1、MCP-1和IκB-α mRNA的变化 收集细胞于无RNA酶离心管中，加入1 mL Trizol，后加入200 μL氯仿，震荡充分混匀。离心，吸上清，加入新的无RNA酶离心管中加入等量的异丙醇，-20 ℃冰箱静置30 min。离心，弃上清，加入1 mL 75%乙醇颠倒洗涤。离心，弃上清，吸干残余液体。晾干数分钟，加适量DEPC水。使用NanoDrop(ND-1000)检测其纯度及浓度。每组取等量的测定浓度的RNA样品500 ng～5 μg，按照cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA。使用Invitrogen荧光定量试剂盒，按说明书避光配置总体系，体积20 μL，单样本cDNA及每对引物均需要设置3个复孔，以减少误差。利用2-△△Ct对目标基因的相对表达量进行分析。
1.2.4Western Blot检测细胞ICAM-1、MCP-1和IκB-α蛋白表达 将细胞培养24 h后，收集细胞悬液离心，弃上清，加入适量细胞裂解液。冰上裂解30 min，后离心取上清。之后进行蛋白定量，取含等量蛋白细胞裂解液，煮样。之后进行SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)，采用10%的分离胶和5%的浓缩胶。先稳定电压90 V电泳，待进入分离胶后，换稳定电压120 V。电泳结束后，半干转膜20 min。转膜结束后用含5%脱脂奶粉的TBS液室温孵育1 h。将封闭后的膜孵育按比例稀释的一抗，ICAM-1抗体(1∶800)，MCP-1抗体(1∶500)，IκB-α抗体(1∶1 000)，GAPDH抗体(1∶1 000)。4 ℃摇床过夜。洗膜4次，5 min/次。封闭二抗(1∶10 000)室温孵育1 h。之后再次洗膜4次，孵育发光液，化学发光成像分析仪扫描成像。
1.2.5免疫荧光检测NF-κB p65蛋白分布 细胞爬片后，给予相应处理，之后加入4%的多聚甲醛固定。室温PBS缓冲液洗两次，滴加含0.1% Triton、5%山羊血清的缓冲液PBS打孔封闭。加入适量的缓冲液PBST洗2次。将NF-κB p65抗体(1∶100)按比例用含5%山羊血清的缓冲液PBS稀释。孵育小片，4 ℃过夜。加入适量的缓冲液PBST，室温洗3次。避光配置荧光二抗(1∶250)孵育小片，室温避光结合1 h。在暗室加入适量的缓冲液PBST，室温洗3次，之后用缓冲液PBS洗1次。在暗室取干净的载玻片，将小片放置在上，中间滴加适量的DAPI染液，盖盖玻片。室温静置1 h左右，使用激光共聚焦显微镜观察。以上实验均重复3次。
1.3统计学方法 应用Prism 6软件进行数据分析。计量资料比较采用单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1LIR抑制VSMCs炎性因子的分泌 与NC组相比，在TNF-α刺激下TNF-α组VSMCs培养基中的炎性因子IL-1β和IL-6可显著升高(P<0.01)。与TNF-α组相比，TNF-α+LIR组VSMCs培养基中的炎性因子IL-1β和IL-6可显著降低(P<0.01)。见表1。
表1 各组VSMCs炎性因子的表达 Table 1 The expression of inflammatory factors in VSMCs in each group
2.2LIR促进circ-sirt1的表达 与NC组相比，在TNF-α刺激下TNF-α组VSMCs培养基中circ-sirt1显著降低(P<0.05)。而与TNF-α组相比，TNF-α+LIR组细胞中circ-sirt1表达显著升高(P<0.05)，见表2。
表2 各组circ-sirt1的表达变化Table 2 The expression changes of circ-sirt1 in each group
2.3LIR抑制VSMCs炎症应答 为进一步探究LIR对VSMCs炎症应答的作用，qPCR检测细胞ICAM-1、MCP-1和IκB-α mRNA的变化。与NC组相比，TNF-α组细胞炎症标志分子ICAM-1和MCP-1 mRNA的表达显著升高(P<0.01)。与TNF-α组相比，TNF-α+LIR组ICAM-1和MCP-1 mRNA的表达显著下降(P<0.01)，见表3。以上结果提示，LIR可抑制TNF-α诱导的VSMCs自身炎症因子的表达。进一步检测了NF-κB信号通路的抑制因子IκB-α mRNA的表达。与NC组相比，TNF-α组细胞炎症标志分子IκB-α mRNA的表达显著降低(P<0.05)。与TNF-α组相比，TNF-α+LIR组IκB-α mRNA的表达显著上调(P<0.05)，见表4。进一步用Western blot检测细胞ICAM-1、MCP-1和IκB-α 蛋白的变化，与相应mRNA的变化趋势一致(图1)。
表3 各组炎性因子ICAM-1、MCP-1的表达Table 3 The ICAM-1 and MCP-1 expression of inflammatory factors in each group
表4 各组炎性因子IκB-α mRNA的表达Table 4 The IκB-α mRNA expression of inflammatory factors in each group
图1 各组炎性因子蛋白水平的表达
2.4LIR抑制NF-κB p65的核转位 NF-κB信号通路激活引起NF-κB p65的核转位。为进一步证实LIR对TNF-α诱导VSMCs的NF-κB信号通路激活的作用，进行免疫荧光实验，观察NF-κB p65的分布。绿色荧光显示的是NF-κB p65。结果表明(图2)，NC组细胞中NF-κB p65主要分布在胞浆，而给予TNF-α刺激后，NF-κB p65发生了明显的核转位，主要分布在细胞核。与TNF-α组细胞相比，TNF-α+LIR组细胞中NF-κB p65胞浆分布增多，而胞核分布减少。上述结果表明，LIR通过抑制NF-κB p65的核转位，进而抑制NF-κB信号通路的激活。
图2 LIR抑制NF-κB p65的核转位
血管损伤会引起炎症反应，炎症反应已被证明在原发性高血压、动脉粥样硬化及冠状动脉术后血管在狭窄等一系列心血管疾病中发挥十分重要的作用[10]。早期引起的炎症反应可启动血管修复机制，促进动脉重塑过程，该过程通常伴有血管内膜新生。然而，长期的慢性炎症反应则可以刺激内膜过度增生，诱导VSMCs由收缩表型向合成型表型转化，分泌大量炎性介质，同时发生增殖、迁移，参与新生内膜的形成，引起管腔狭窄等[11-13]。有研究表明，异常活化的NF-κB可加重炎症反应，同时也可以引起免疫应答异常。在糖尿病并发症的发生发展过程中，NF-κB发挥重要作用[14]。环状RNA(circular RNA，circRNA)作为一类特殊类型的非编码RNA，越来越多的研究表明其参与了血管疾病的发生发展。因此，探究如何抑制血管炎症，以及circRNA在血管炎性疾病中的作用，对于心血管疾病的治疗有着至关重要的意义。
近年来，LIR在心血管疾病中的研究越来越多，尤其是在AS和血管损伤后的内膜新生方面。Koshibu等[15]研究发现，LIR对44只链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的高血糖小鼠具有AMPK依赖性抗动脉粥样硬化作用，其可能抑制了AMPK依赖的血管内皮细胞促动脉粥样硬化分子生成的作用。Kushima等[16]在野生型小鼠实验中发现，LIR治疗时剂量依赖性地减少了新生内膜面积。进一步在实验中发现，LIR剂量依赖性地刺激NO的产生。最后结果表明，在严重高血糖的db/db小鼠中，LIR治疗也抑制了新生内膜增生，伴血管细胞增殖和密度下降。此外，LIR治疗可抑制动脉损伤后7 d的高血糖和血管炎症。Tsai等[17]研究表明LIR被发现能够部分通过抑制内皮间质转化(endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT)抑制糖尿病小鼠的新生内膜形成，进一步明确了LIR的潜在血管新生内膜的治疗作用。
上述研究大部分研究目标集中在动物或者内皮细胞中，然而，LIR是否都对作为血管壁细胞主要组成的VSMCs同样有治疗作用？用TNF-α刺激VSMCs构建血管炎症体外模型，LIR进行干预。首先，检测了细胞培养基中促炎因子IL-1β和IL-6的表达，发现LIR显著降低了TNF-α诱导的IL-1β和IL-6的表达，表明LIR能够减轻VSMCs受炎症刺激时诱导的局部炎症反应。ICAM-1是介导细胞间的黏附反应重要因子。正常情况下，在血管内皮细胞中低表达，一旦发生血管损伤，内皮细胞会异常大量表达ICAM-1，高表达的ICAM-1可以介导单核细胞向受损伤的内皮细胞聚集并分化成炎症巨噬细胞。而在AS的发生发展中，平滑肌细胞也会出现ICAM-1的异常高表达，促进AS病情进展[18]。MCP-1是趋化因子家族成员之一，能够诱导各种炎症细胞向炎症部位募集，是调节单核/巨噬细胞迁移和浸润的关键趋化因子之一[19]。为进一步探究LIR对VSMCs炎症应答的作用，检测了炎性标志分子ICAM-1、MCP-1的表达，发现LIR能够显著抑制ICAM-1和MCP-1 mRNA和蛋白的表达而抑制炎症反应。
ICAM-1和MCP-1作为机体炎症反应的重要标志分子，其表达均受到NF-κB信号通路的调节[20-21]。众所周知，IκB-α是NF-κB信号通路的天然抑制因子。细胞在未受到刺激的情况下，IκB-α与NF-κB p65、p50三者形成复合物，使得NF-κB p65滞留下胞浆，处于失活的状态。一旦细胞受到炎症刺激，IκB-α会发生磷酸化改变，之后进一步进行泛素化降解，NF-κB p65被解离，由失活状态转变成活化状态，其自身的核定位序列暴露，进而发生细胞核转位，NF-κB 信号通路被激活。因此，进一步检测了mRNA和蛋白的表达，结果发现LIR能够显著减弱TNF-α诱导的IκB-α表达抑制。Kang等[13]研究证实，circ-Sirt1通过序列特异性相互作用抑制NF-κB p65的核易位发挥抗炎作用，因此为证实LIR是否同样通过上述信号通路够影响VSMCs进而改善血管炎症，检测了circ-sirt1的表达变化，发现LIR可显著促进TNF-α刺激的VSMCs 中circ-sirt1的表达。免疫荧光进一步证实，LIR能够显著抑制TNF-α诱导的NF-κB p65蛋白核易位，提示LIR可能通过促进circ-Sirt1的表达发挥抑制VSMCs炎症反应作用。
综上所述，LIR可以抑制VSMCs分泌炎性介质减轻局部炎症，同时促进circ-sirt1的表达进而抑制细胞NF-κB信号通路的活化，进而抑制血管炎症。然而，LIR是否在体内也能发挥同样的作用，有待动物实验的进一步验证。
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