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王 静，李 潇，邓 杰，周长明
（北京市药品检验研究院，国家药品监督管理局仿制药研究与评价重点实验室，中药成分分析与生物评价北京市重点实验室，北京 102206）
复方营养混悬剂是一类基质复杂、有效成分较多的特殊用途药物制剂，主要用于满足无法通过正常饮食获得足够营养需求的患者、癌症患者和极低出生体重的婴儿[1-4]。处方中的有效成分达30余种，其中维生素E有调节机体免疫功能[5]，影响许多与炎症、细胞存活或凋亡、血管生成、肿瘤发生和衰老等相关的细胞信号传导途径[6]，从而改善血液循环，促进新陈代谢，提高机体免疫力，延缓衰老。近年，有关维生素E含量测定的研究报道较多[7-10]，但多是以维生素E为主要成分的制剂，而如复方营养混悬剂这类维生素E所占处方比例相对较低的药物，相关质量研究的报道较少。为了更好地控制产品质量，本文建立了高效液相色谱法（HPLC）测定复方营养混悬剂中维生素E的含量。采用此方法可准确测定该品种中维生素E含量，为产品质量控制提供技术支撑。
1.1 仪器
岛津公司LC-20AT高效液相色谱仪（LC-20AT泵，SIL-20AC自动进样器，CTO-20AC柱温箱，SPD-M20A二极管阵列PDA检测器，Lab-solution工作站）；
Mettler Toledo公司XA205电子天平；
PALL公司纯水机；
北京桑翌科技发展有限公司恒温培养摇床；
BUCHI公司Rotavapor R-3真空旋转蒸发仪。
1.2 试药
2个厂家6批复方营养混悬剂，企业A批号：1709002，1709003，1709004；
企业B批号：180101，180140，190204；
维生素E对照品，批号：100062-201811，纯度：98.0 %，中国食品药品检定研究院；
甲醇为色谱纯，EMD Millipore公司；
石油醚（30～60 ℃）为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
2.1 色谱条件与系统适用性
色谱柱：Merck Hibar 250-4 LiChrosob RP-18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；
流动相：甲醇；
流速：1.0 ml/min；
检测波长：280 nm；
柱温：35 ℃；
进样量：20 μl；
理论塔板数按维生素E峰计算应不低于2000。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液 取维生素E对照品约25 mg，精密称定，置入50 ml量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取上述溶液1 ml，置入10 ml量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2.2 供试品溶液 取样品约5.0 g，精密称定，加水25 ml，摇匀，置入锥形瓶中，加乙醇25 ml，并精密量取石油醚（30～60 ℃）20 ml，强力振摇15 min，静置使分层，再精密量取醚层10 ml，40 ℃下于真空旋转蒸发仪上蒸干后，精密加入甲醇2.5 ml，振摇使残渣溶解，滤过，取续滤液，即得。
2.3 方法学验证
2.3.1 线性关系 取维生素E对照品20 mg，精密称定，置入20 ml量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液。精密量取储备液1，2.5，1，1，1 ml，分别置入于100，100，20，10，5 ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度分别为0.01，0.025，0.05，0.1，0.2 mg/ml系列对照品溶液。按2.1项色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品浓度X （mg/ml）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=4 083 412.5X+4805.9，r=0.9999。结果表明，维生素E进样浓度在0.01～0.2 mg/ml范围内线性关系良好。
2.3.2 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液，按2.1项色谱条件连续进样5针，峰面积和保留时间的RSD分别为0.19 %和0.08 %。结果表明，进样精密度良好。
2.3.3 重复性试验 取同一批样品，按2.2.2项方法制备供试品溶液6份，按2.1项色谱条件进样，测得含量分别为113.2 %，112.8 %，109.4 %，109.5 %，111.3 %，113.0 %，其RSD为1.57 %。结果表明，本方法重复性良好。
2.3.4 检测限和定量限 取对照品溶液适量，用甲醇逐级稀释，按2.1项色谱条件进样检测。当进样浓度为0.45 μg/ml时，信噪比约为3:1，即检测限为0.45 μg/ml；
当进样浓度为1.75 μg/ml时，信噪比约为10:1，即定量限为1.75 μg/ml。
2.3.5 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品5.0 g，分别精密加入维生素E对照品溶液0.15，0.25和0.35 mg，制成低、中、高3个质量浓度的供试品溶液，每个质量浓度制备3份，按2.1项色谱条件进样，计算回收率，结果见表1。
表1 回收率试验结果
2.3.6 专属性
2.3.6.1 系统适用性试验 取对照品溶液和供试品溶液，按2.1项色谱条件进样，色谱图见图1。理论塔板数按维生素E峰计算大于2000。
图1 系统适用性试验HPLC图
2.3.6.2 破坏试验 取供试品溶液，进行如下破坏试验：① 碱破坏：取供试品溶液400 μl，加入1 mmol/L氢氧化钠溶液10 μl，摇匀，室温放置30 min，再加入1 mmol/L盐酸溶液10 μl，摇匀；
② 酸破坏：取供试品溶液400 μl，加入1 mmol/L盐酸溶液10 μl，摇匀，室温放置30 min，再加入1 mmol/L氢氧化钠溶液 10 μl，摇匀；
③ 氧化破坏：取供试品溶液300 μl，加入1 %的过氧化氢10 μl，摇匀，室温放置15 min；
④ 高温破坏：取供试品溶液在55℃ 放置1 h，放冷至室温；
⑤ 光照破坏：取供试品溶液，在4000 lx下光照24 h，摇匀，即得。分别取破坏后的溶液各20 μl，注入液相色谱仪，按2.1项色谱条件测定，记录色谱图（图2）。结果各破坏条件下产生的杂质峰与维生素E主峰达到有效的分离，对测定无干扰，表明该方法专属性良好。
图2 破坏试验HPLC图
2.3.7 稳定性 取同一份供试品溶液，分别在0，4，8，12，24 h重复进样测定，记录峰面积，RSD为1.18 %。结果表明，维生素E供试品溶液在24 h内稳定性良好（室温避光条件下）。
2.3.8 耐用性的考察 通过调节流速、柱温和更换不同品牌C18色谱柱，考察维生素E主峰的变化情况。结果表明，维生素E 峰的理论塔板数均大于2000，表明该方法耐用性良好。
2.4 样品含量测定
取2个厂家6批样品共12份，分别按2.2.2项方法制备供试品溶液，按2.1项色谱条件测定，记录峰面积。按照外标法计算复方营养混悬剂中维生素E的含量，结果见表2。维生素E含量在90.6 %～109.5 %。
表2 含量测定结果
3.1 关于维生素E的问题
维生素E结构复杂，同系物多，在不同行业和不同标准中，其定义也不同[11]。进口肠内营养类药物质量标准中检测的维生素E为α-生育酚，分子式是C29H50O2。现行国内复方营养混悬剂质量标准中是以维生素E为标准品，其分子式是C31H52O3。此外，《中国药典》[12]收载的维生素E原料及制剂均以维生素E计算。本文以现行质量标准中采用的维生素E为对照品，进行维生素E的含量测定研究。
3.2 样品提取方法的选择
在进口肠内营养类药物质量标准中，将维生素E皂化成α-生育酚后进行检测，前处理过程复杂，不确定因素较多，检测结果偏差较大。本文采用石油醚一步提取维生素E，避免了反复提取可能造成的损失。实验中考察了配制供试品溶液时水和乙醇中维生素E残留量，结果未发现维生素E色谱峰，色谱图见图3，说明石油醚提取维生素E效率高。维生素E溶于石油醚中，两次量取均采用精密量取的方式，能减少不确定因素，达到良好的重复性。
图3 样品提取方法考察HPLC图
3.3 流动相的选择
维生素E属于脂溶性维生素，极性弱，一般采用反相液相色谱法分离此类极性较弱的样品。实验中分别采用甲醇、甲醇-水（98:2）、甲醇-水（95:5）为流动相，结果表明，增加水相比例，维生素E出峰时间延长，峰型变宽，检测灵敏度降低。所以选择纯有机相甲醇为流动相，也与现行质量标准中维生素E鉴别项的流动相一致。
3.4 色谱柱的选择
以甲醇为流动相，考察了维生素E对照品溶液在Merck、Kromasil和Phenomenex 3个品牌的C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）的出峰情况。色谱图见图4，采用Phenomenex色谱柱时峰形不如其他两个色谱柱，采用Merck和Kromasil色谱柱时主峰峰形良好，且均能达到理论塔板数要求，其中Merck色谱柱的理论塔板数最高，所以综合峰型和理论塔板数的要求，最终选择Merck色谱柱。
图4 色谱柱考察 HPLC图
3.5 结论
本文采用高效液相色谱法建立了复方营养混悬剂中维生素E含量测定方法。复方营养混悬剂有效成分繁多，维生素E在处方中的含量较低，需采用有效的前处理方法和灵敏的检测手段进行测定。本研究建立的方法满足了含量测定方法学验证的要求，为复方营养混悬剂中维生素E的质量控制提供了新的技术手段。
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