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施永德，陈季武
（1.复旦大学上海医学院生物物理学教研室，上海 200032；
2.华东师范大学生命科学学院，上海 200062）
对人类的动脉粥样硬化、肌肉蒌缩、骨骼疏松等疾病的研究，引起了力对有关细胞作用的研究，如内皮细胞[1-2]、白细胞[3]、红细胞[4]、血小板[5]、肌肉细胞[6]、骨骼细胞[7]等的受力后的变化。在植物中力对含羞草（Mimosa pudicaL.）的作用是一个良好模型，当它受力时，其叶立即往上卷、叶茎马上往下垂、叶枕发生下弯。以往对于含羞草细胞受力当即作出的反应性研究主要集中于膜电位[8]、细胞充盈性[9]和跨膜离子流[10]等。根据文献对于含羞草受力以后发生运动的机制可归纳为以下几种学说：(1)渗透压学说：认为叶茎之弯曲是由于叶枕腹侧充盈压力突然丧失，而叶枕背侧充盈压力突然增大所致，此过程涉及在力刺激源处所发生的动作电位，通过木质部（植物纤维束）和韧皮部而传入叶枕实质细胞（parenchyma cells），它即诱导叶枕实质细胞的K+、Cl-、H+等离子的跨膜转运[11-12]，同时伴随着细胞水分和渗透压的改变，引起细胞充盈性的改变，故导致含羞草的弯曲运动[13-14]。(2)离子通道和动作电位学说：认为力作用下有明显动作电位发生[15-16]，含羞草中存在着H+-ATPase并协同管理着H+的运输[17-19]。不论叶子的光照刺激引起的慢运动[20]和力刺激引起的快运动[21]，均有明显的离子流发生。第二种信使的钙离子在动、植物细胞传递信息过种中起着重要作用。如植物的气孔运动，时间节律性植物的运动，均由充盈度中介的和由光的亮与暗来调节的[22-23]。含羞草的叶枕在运动时，其实质部细胞里的液泡和质外体中的钙离子迅速进入细胞浆中[24-25]，并与细胞浆中的微纤维相结合而导致运动的。(3)细胞骨架与力学感受传导学说：肌动蛋白（actin）是动物肌肉细胞和非肌肉细胞骨架的基本结构，在动物细胞形态维持、细胞自身迁移、细胞分裂中起到决定性作用。在植物细胞中，肌动蛋白细胞骨架和微管参与细胞生长、有丝分裂、细胞浆的变形与流动[26-31]。研究[32]认为含羞草的运动类似于动物肌肉的收缩，有报告[33]认为细胞松弛素B（cytochalasin B）和鬼笔毒环肽（phalloidin）是影响肌动蛋白细胞骨架结构的物质，使含羞草失去对于外力的反应性。经细胞松弛素D处理后，抑制了含羞草的运动[34]，而秋水仙素（colchicine）和炔苯酰草胺（propyzamide）这两个可以破坏细胞微管的药品却没有影响此行为。还有报告[35]认为含羞草运动与肌动蛋白的酪氨酸磷酸化有关，用氧化苯胂（phenylarsine oxide）这一蛋白质酪氨酸磷酸化抑制剂，既抑制了肌动蛋白的去磷酸化，又抑制了含羞草叶枕的弯曲运动，认为含羞草叶枕弯曲过程中肌动蛋白酪氨酸磷酸化水平的下降改变了肌动蛋白的自组装的性质和调节了肌动蛋白细胞骨架的自组织结构。在含羞草的受力后运动中，叶枕中的实质部细胞在接受力信号以后，有多种途径可以调节肌动蛋白细胞骨架结构[36]。当在酵母菌、脊椎动物、非脊椎动物发现各种各样调节肌动蛋白细胞骨架结构的蛋白质时，吸引一些工作者在高等植物中进行发掘，这也就带动了在含羞草中寻找胶溶蛋白（gelsolin）和片段化蛋白（fragmin），这两种蛋白是具有调整肌动蛋白细胞骨架的家族成员[34]。细胞骨架的动态重组与发生运动，应该与细胞表面与内部的力学感受器相连接着的[37-38]。以上三种学说是互相联系着的，如渗透压改变依靠K+、Cl-、H+等离子和水的跨膜运输实现的；
而离子通道又是管理着离子和水的运输，与细胞渗透压和充盈性相关；
又如细胞骨架的重组与运动，离不开钙离子的介入[24]，也与力学感受装置接受和传导信号有关的[37-38]；
蛋白质酪氨酸磷酸化既与细胞骨架重建有关[35]，也与水通道的调节有关[39]。今后对于含羞草的受力后运动机制上，在细胞骨架的重组及其运动的研究将占有重要的地位，因为它管理着细胞的力信息传导、离子通道的开关、肌动蛋白细胞骨架和微管系统的运动中的收缩与舒张。引起含羞草的运动的原因具有多元化，除了力以外，还有光[20]和电[40]均可以引起。从生物力学角度看含羞草受外力作用后，除形态学变化外，还应伴随着其内部有关物质结构的改变，如某些蛋白分子在三维结构上的重排与构型变化。我们以往研究过外力对含羞草叶匀浆的逆时针力学滞后环，并与叶下珠（Thyllanthus urinaria）叶匀浆等作了对比，结果支持含羞草受剪切力后，细胞内存在某种物质，由分散性组织向有序性排列，由颗粒状向网状重排，由液体性向黏弹性体性变化。实验支持外力信号传入细胞内以后，含羞草内部某种物质（推测是肌动蛋白细胞骨架及其中介的蛋白质如胶溶蛋白和片段化蛋白家族和其他细胞内的参与的物质）改变了肌动蛋白细胞骨架网络系统；
当力撤去以后这种改变回复至原先状态[41]。本文则继续从生物力学角度，进一步研究含羞草叶匀浆对矩形波切变率的反应性及其对Maxwell方程的拟合与修正，拟进一步揭示含羞草叶匀浆在微弱剪切应力作用下，变成有明显黏弹性体的过程，支持含羞草细胞内有蛋白质和细胞骨架在剪切应力下由液体结构向黏弹性体结构转变的观点。
1.1 无细胞含羞草叶匀浆的制备 用纯水以玻璃匀浆器制成，用3层纱布过滤，在室温中静止1 h后，将上述悬浮液吸出置入流变仪测量杯中进行实验。
1.2 仪器 采用美国Brookfield公司程序型DVⅡ流变仪，在Windows下，以该公司提供的软件，编制自动采样程序，作数据采集、贮存、回归拟合、数据处理等。切变率矩形波数值由仪器和电脑软件控制，每次测定前样品在测量杯中静止20 min，以消除在实验过程中外力对含羞草匀浆的作用。时间设定由0 s开始，给以0 s-1切变率计时采样10 s后，然后施加矩形波切变率（分别为0.1、1、2、4、8、10、12 s-1）实时采样60 s，然后撤去矩形波切变率后继续实时采样60 s（每次收集130 s，每秒收集一个数据）。由仪器自动同时采集切应力（mPa）、切变率（s-1）、温度（℃）、时间（s）等数据。以应力（mPa）为纵坐标、时间（s）为横坐标，由本实验室自编软件画出应力-时间曲线图。
1.3 含羞草匀浆的浓度控制 新鲜匀浆装入毛细管中，离心，读取压实体积，然后控制浓度为15%的压实体积进行测量。配好如上浓度匀浆液后在26.4℃静放1 h。实验结束后取2 mL匀浆在30 ℃烘干称干重，其干重浓度为23.65 mg/mL。
1.4 对照样品
1.4.1 叶下珠匀浆：叶下珠的叶子按如上方法制成匀浆，也控制浓度为15%的压实体积，按照如上条件进行测量。实验结束后取2 mL新鲜悬浮液在30 ℃充分烘干称干重，其干重浓度为21.8 mg/mL。
1.4.2 纯水：双重蒸馏水。
1.5 实验温度 控制为(26.4±0.1)℃（采用成都仪器厂出品的冷热双相调控恒温水泵自动控制）。
2.1 实验数据与Maxwell方程的拟合与修正 图1是含羞草叶匀浆在切变率矩形波作用前10 s内静止时、切变率2 s-1矩形波作用60 s时与切变率2 s-1矩形波撤销后60 s的应力与时间自动采样的结果，以及与Maxwell方程的拟合的情况。
图1 含羞草匀浆液在施加切变率2 s-1矩形波前的10 s时间、施加切变率2 s-1矩形波时60 s的阶段与撤销切变率2 s-1矩形波后60 s期间的应力（mPa）与时间（s）的自动采样结果（系列2），及其与Maxwell方程理论计算值（系列1）的比较。可见其应力上升线两者几乎完全符合（经χ2检验，P＞0.05），其应力下降线两者形状虽然相似，但在数值上明显有差异（经χ2检验，P＜0.05）。图中Maxwell曲线的τ0（应力平衡值）为923 mPa，λ（应力松弛或应力滞后时间）为10.00 s。
图2示含羞草叶匀浆在切变率矩形波作用前10 s内静止时、切变率2 s-1矩形波作用60 s时与切变率2 s-1矩形波撤销后60 s的应力与时间的自动采样的结果，以及与本文修正后的Maxwell方程的拟合的情况。
图2 含羞草匀浆液在施加切变率2 s-1矩形波前的10 s时间、施加切变率2 s-1矩形波时60 s阶段与撤销切变率2 s-1矩形波后60 s期间的应力（mPa）与时间（s）的自动采样结果（系列2），及其与本文修正后的Maxwell方程理论计算值（系列1）的比较。可见其应力上升线与下降线两者几乎完全符合（经χ2检验，P＞0.05）。
Maxwell黏弹性体的应力τ与时间t关系的上升线表达式为：
式中τ0为应力平衡值，λ为应力松弛时间，这两个方程参数决定了整个方程曲线的形状。其应力τ与时间t关系的下降线表达式为：
上式中的λ＝η/G，即黏弹性体的黏性（η）与弹性模量（G）的比值。图1所示的曲线的τ0为923 mPa，λ为10.00 s的结果，可见其实验值与Maxwell方程理论计算值结果做比较，其应力上升线两者之间几乎完全符合（经χ2检验，P＞0.05）。然其应力下降线实验数值，与计算结果之间有明显差异（经χ2检验，P＜0.05）。为此我们考虑将（2）式加以修正，根据我们的推理与观察改成为如（3）式所示：
（3）式中右侧第二项，是我们根据图1所示理论值与实验值之间的差异而加入的。（3）式中△τ为实验平衡值与（2）式的原Maxwell方程的理论计算平衡值τ0之间的差值，我们把这项称之为“不可逆应力损失项”，图2展示（3）式的理论计算结果与实验结果的相符性（经χ2检验，P＞0.05）。图2中的△τ的数值为167.77 mPa。如此（3）式的修正方程是由τ0、λ和△τ三个参数来描述的。如上结果认为，含羞草叶匀浆对于矩形波切变率的反应性，在某种情况下可以用Maxwell方程的上升线与本文修正的下降线进行拟合的。对于（3）式中右侧加入的“不可逆应力损失项”的理由，我们认为是含羞草叶匀浆系统在矩形波切变率驱动下作了“功”以后产生了“不可逆的应力损失”，其可能原因有：(1)有“惯性”作用，回复原先状态需要更长的时间；
(2)做“功”后系统有疲劳状态，暂不能恢复原状；
(3)做“功”过程中消耗内部能量与相应物质，系统中后续的供应不能及时或不完善；
(4)做“功”过程中内部有损伤并留下不可逆后遗痕迹等。根据“不可逆应力损失项”的存在，如果给同一个含羞草叶匀浆样本，用同一数值的切变率矩形波做多次连续重复实验，经过n次后其切应力（τ），会如同阻尼振动一样淹没在“不可逆应力损失项”中（如图3所示）。
图3 根据“不可逆应力损失项”的存在，如给同一个含羞草叶匀浆样本，用同一切变率矩形波做n次连续重复实验后，纵坐标为相对切应力，横坐标为相对时间，会如同阻尼振动一样随着n次的进行，其纵坐标应力变化会淹没在“不可逆应力损失项”之中。
式中λ是一个方程的参数，具有时间的量纲（但并不是时间），在物理学与力学上称之为松弛时间，是该物体的黏度η与弹性模量G的比值（η/G）。通过实验和理论计算可知，凡具有λ数值或越大的物体，应力-时间曲线是黏弹性体的、圆滑的礼帽形状的；
而λ数值几乎为零的物体，其应力-时间曲线就越接近矩形，这是属于牛顿性液体类型的。因此从实验曲线的形状和λ的数值大小，可确定对被测物体黏弹性的定性与定量。
2.2 不同切变率矩形波作用下含羞草叶匀浆应力-时间曲线的Maxwell方程参数值 图4示切变率0.1、1、2、4、8、10、12、15 s-1等8种矩形波作用下的含羞草叶匀浆的应力-时间曲线图形。可以看出都是属于圆滑的礼帽状的黏弹性曲线类型，均可认为该匀浆液在不同切变率矩形波作用下，有变成为黏弹性体的趋势。尤其是切变率0.1、1、2、4 s-1等4种低切变率矩形波作用下的曲线图形更为明显，并具有明显的松弛时间λ参数值，也展示它们在不同切变率矩形波作用下，呈现黏弹性体曲线的结果（但图中还可以看出当切变率增大时，其曲线的形状逐步地由礼帽状的黏弹性曲线类型形态，向矩形的形态转移）。
图4 本文所设计的8种切变率矩形波（系列1为0.1 s-1、系列2为1 s-1、系列3为2 s-1、系列4为4 s-1、系列5为8 s-1、系列6为10 s-1、系列7为12 s-1、系列8为15 s-1）作用下的含羞草叶匀浆悬浮液应力-时间曲线图形。纵坐标为应力，单位mPa；
横坐标为时间，单位s。
表1示本文设置的8种切变率矩形波作用下含羞草叶匀浆悬浮液的Maxwell方程应力上升线与本文修正后应力下降线计算出的方程参数松弛时间参数λ（s）、应力平衡值参数τ0（mPa）和“不可逆应力损失项”的△τ（mPa）数值。此三个方程参数决定了曲线的走向。
表1 8种切变率矩形波作用下含羞草叶匀浆悬浮液的应力时间曲线Maxwell方程参数值
2.3 含羞草、叶下珠叶片匀浆悬浮液、纯水的应力-时间曲线的比较
2.3.1 曲线形状与有关测定值的比较：表2示含羞草、叶下珠与水在切变率矩形波作用前10 s、作用中60 s与撤消后60 s的应力-时间曲线形状与有关情况的比较。
表2 含羞草、叶下珠、水在切变率矩形波作用下的应力-时间曲线形状与有关测定值的比较
2.3.2 松弛时间参数值（λ，单位s）比较：从表3和图5可以明显看出，含羞草系列具有明显的松弛时间参数值，而叶下珠系列的松弛时间参数值均为零。特别是低切变率的矩形波，如0.1、1、2、4 s-1各切变率矩形波，具有较大的数值。这说明检测含羞草接收切变率的刺激，诱发内在应力的发生拟应用低切变率，如果使用过高的切变率矩形波，则会淹没掉含羞草匀浆液自身产生的应力与松弛时间参数。生命系统中许多物质，如血液细胞，如果应用200 s-1或300 s-1数值的切变率进行剪切后实验，获得的数据其误差会远远超过原先存在数值的本身。本文实验结果展示，生命细胞系统敏感的切变率在4 s-1以下，过大切变率不敏感、不合适。
表3 含羞草和叶下珠匀浆悬浮液在切变率矩形波作用下的根据Maxwell应力上升线方程获得的松弛时间参数值λ的比较
图5 含羞草（前排）和叶下珠（后排）匀浆液在不同切变率矩形波（横坐标，单位s-1）作用下的松弛时间λ参数值（纵坐标，单位s）的比较（注意后排均为0）
获得的松弛时间参数值λ，本文采用两个方法，一是自编软件曲线回归最小误差法，二是半产期或半衰期计算法。经试验两者符合。虽然叶下珠的应力-时间曲线不符合Maxwell方程的上升线，我们为了作两个系列的松弛时间参数值对比，不得不主观地按同样方法做。
2.3.3 平衡应力数值（τ0，单位mPa）比较：从表4和图6可知，在相同物质浓度的叶匀浆悬浮液条件下，在各自的切变率矩形波作用60 s时，含羞草与叶下珠两个系列，所给出的平衡应力值差异具有统计学意义（P＜0.001）。平均含羞草比叶下珠大20多倍，显示在矩形波切变率的刺激下，含羞草匀浆悬浮液具有明显内部发力的现象，而叶下珠则几乎没有的。我们采用叶下珠为对照，原因在于叶下珠在外形上相似于含羞草，但不具有含羞草受力后变形的功能。
图6 含羞草（前排）与叶下珠（后排）8种切变率矩形波作用下平衡应力（纵坐标：单位mPa，已经折合成mPa/(mg干组织·mL)，即在各切变率矩形波下作用60 s时的平衡值；
横坐标：矩形波的切变率，单位s-1）
表4 含羞草与叶下珠8种切变率矩形波作用下平衡应力值的比较
含羞草叶片匀浆在施加矩形波切变率时，即呈现黏弹性体结构的应力-时间上升曲线，可用Maxwell黏弹性体方程加以拟合；
当撤去矩形波切变率后的应力-时间下降曲线，其形状虽然与Maxwell黏弹性体方程相似，但是在数值上有明显差异，本文加上“不可逆应力损失项”加以改良，则即可拟合。
从0.1、1、2、4、8、10、12、15 s-1的8种不同切变率矩形波作用下含羞草叶匀浆应力-时间曲线形状可认为，它们均属于圆滑的、礼帽状的黏弹性体类型曲线，尤其是切变率0.1、1、2、4 s-1等4种低切变率矩形波作用下的曲线更为明显。本文对它们的Maxwell方程应力上升线参数松弛时间、应力平衡值和改良后方程应力下降线“不可逆应力损失项”等的参数数值进行了计算。同时也可以看出，切变率加大后（如8、10、12、15 s-1）的后果是，曲线的黏弹性形状越来越失去，逐步接近矩形化，越来越接近牛顿流体。由于我们的流变仪在测定力学数值上是有限度的，最大限度是2 300 mPa，因此我们没有继续加大切变率进行下去。但是这里可以推论，任何黏弹性体物质，如果无限制地加大切变率，其结果是必然失去原有的黏弹性行为，而变成牛顿流体或触变性流体行为。因此同一物体在论及黏弹性、触变性、牛顿性与非牛顿性时，要考虑所接受的切变率的高低的条件而论。
对含羞草、叶下珠叶片匀浆悬浮液、纯水进行了实验比较，前者具有黏弹性体的特有应力-时间曲线形状，后两者则无；
含羞草具有明显的松弛时间参数值，而叶下珠则无；
在相同物质浓度的情况下，含羞草具有比叶下珠大20倍平衡应力数值，说明含羞草在接受应力的作用后发出明显应力，这应力的存在必然来自匀浆液自身内部的物质系统（如生物化学的ATP产生机制）。
本文实验支持微弱的剪切应力好像“酶”一样，可以驱动含羞草叶子发生运动的过程中，在于细胞内存在着细胞骨架的物质，如Ghosh等[29]报道分离到肌动蛋白，Mukherjee等[30]和Pal等[31]分别报道分离到微管蛋白（tubulin），Yamashiro等[34]报道分离到胶溶蛋白和片段化蛋白，这些都是参与构成细胞骨架的重要蛋白质。
推测这些蛋白按照时间与空间，在力作用下由无序成为有序、由分散达到聚集，由颗粒变为三维结构，由液体变化成为黏弹性体；
而外加的应力撤销以后，慢慢地回复原先状态。本文应用切变率矩形波技术与改良后的Maxwell方程，是研究生物物质的黏弹性的一个补充手段，还认为含羞草匀浆在矩形波的切变率控制在0.1～4 s-1范围是较敏感的。至于如何从分子生物学与结构生物学角度进一步研究力对活细胞的作用，将是一个值得研究的方向。
本文所实验的匀浆是经过玻璃匀浆管用力研磨后获得的无完整细胞的液体性物质，与天然的植物的生物系统尚有区别。虽然在测定之前有充分时间静放，尽量地让匀浆“忘记曾经受过力的经历”，但仍与天然植物有区别。有幸的是本文所研究含羞草匀浆系统仍具有对微弱的剪切力作用下产生明显切应力的反应性，说明含羞草的植物整体已经被破坏，但是它还活在无细胞的匀浆中，而对照植物叶下珠几乎没有，因此可认为本文的实验结果与推理有可靠性。含羞草匀浆系统今后将是对外力反应性的模型。
本文仅涉及剪切力对含羞草叶匀浆的作用，此外还有不少工作者对含羞草其他方面作了有价值的工作，如在化学成分及其药理、毒理、临床应用有很好报道[42-45]，特别的报道还有含羞草的根茎与幼苗在力的作用下会释放多种含硫化合物[46]。因此对含羞草的基础与应用的研究，今后将有更多发现。
感谢：本文曾受到美国加州大学钱煦院士与德国亚琛应用技术大学Gerhard Artmann教授的有益指导与帮助，在此特别致谢。在流变学软件与硬件技术上得到美国Brookfield公司驻中国的代表处热心指导，在此一并致谢。
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