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张 璐，沈青春，徐锦涛，赵 琪，李 霆，程 敏，张纯萍*
(1.中国兽医药品监察所，北京100081；
2.皇誉宠物食品有限公司，上海 200000)
沙门氏菌是自然界中最常见的人畜共患病原菌，能够引起仔猪的副伤寒、败血症等疾病，而且猪感染后常成为隐性带菌者，不定期排毒，从而感染其他畜禽。更为重要的是，猪所携带的沙门氏菌也是一种重要的食源性病原菌，在我国沙门氏菌食物中毒事件中，90%以上的是由肉类食品引起的，其中猪肉及其产品是主要污染源之一[1]。血清分型是实现病原体溯源分析的主要方法，但沙门氏菌的血清型众多，常规血清分型方法较为繁琐、耗时长，且对于出现交叉凝集或凝集现象不明显的菌株，结果较难判断[2]。沙门氏菌的预防和治疗主要依赖于抗菌药物，但抗菌药物的频繁使用，产生了大量的耐药菌株。目前细菌耐药性已经成为全球共同关注的问题，尤其是在畜牧养殖行业，严重威胁着动物的健康，造成了巨大的经济损失[3]。随着生物信息技术的发展，测序成本的大幅降低和多种公共数据库的创建简便了沙门氏菌血清分型方法和耐药性的检测[4]。国外研究表明，通过全基因组测序，可以简单、快速和高效的检测沙门氏菌的血清型和耐药基因，且具有较好的敏感性和特异性[5-7]，但目前国内相关文章较少。因此，本文选取了我国2011-2015年不同地区分离的60株猪沙门氏菌，利用全基因组测序技术分析沙门氏菌的血清型和耐药性，并与常规检验结果进行了比较，从而分析全基因组测序技术(Whole genome sequencing，WGS)在沙门氏菌血清分型和耐药性分析方面的应用能力。
1.1 菌株来源 猪源沙门氏菌共60株，分离时间为2011-2015年，其中上海14株、四川10株、广东36株。质控菌株为大肠杆菌ATCC 25922和ATCC 35218，均由中国兽医药品监察所安全评价室保存。
1.2 主要试剂和仪器 沙门氏菌诊断血清购自丹麦国家血清研究院，革兰氏阴性细菌鉴定板由本实验室设计、上海星佰生物技术有限公司生产，细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，沙门氏菌全基因组测序分析由奥维森基因科技有限公司完成。
1.3 血清凝集试验 参照沙门氏菌检验标准GBT4789.4-2016[8]，采用传统玻片凝集法对沙门氏菌进行血清型鉴定。O抗原的鉴定需要先在洁净的玻片上滴加1滴诊断血清，然后用洁净的枪头挑取营养琼脂上培养的单菌落与O抗原多价血清充分混匀，晃动30～60 s，出现凝聚现象为阳性反应。如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌落在1 mL生理盐水中做成浓菌液，在酒精灯火焰上煮沸后，若凝集则具有Vi抗原，同时设置无菌生理盐水为对照，在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。H抗原的鉴定则需挑取swarm半固体琼脂培养的周边菌落与H抗原多价血清充分混匀，观察凝集现象。最后根据O相与H相的凝集结果，查阅WHO的White-Kauffmann-Le Minor抗原表[9]确定血清型。
1.4 药敏试验 采用微量肉汤稀释法对不同年代沙门氏菌进行耐药性(磺胺异噁唑、氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、四环素、头孢噻呋、阿奇霉素、复方新诺明、粘菌素、恩诺沙星、氟苯尼考、美罗培南)特征分析：挑取2～3个单菌落置5 mL灭菌生理盐水中，用0.5麦氏比浊管进行比浊，调制菌液浓度为1.5×108cfu/mL左右；
取菌液60 μL加入12 mL的药敏接种培养液中，进行混匀稀释，每孔100 μL，阴性对照孔单独加入100 μL药敏接种培养液，37 ℃恒温培养箱培养18～20 h。在阴性对照孔清澈，阳性对照孔浑浊以及质控菌株的最低抑菌浓度符合规定范围的前提下，根据美国临床实验室标准化委员会标准[10]判断被检菌株是否耐药。
1.5 WGS测序分析
1.5.1 测序 根据细菌基因组DNA提取剂盒说明书提取沙门氏菌DNA，DNA浓度高于100 ng/μL后，送公司经Illumina测序平台测序，然后用Trimmomatic(v0.36)[11]软件进行数据质量控制，使用SPAdes(v3.13.0)[12]软件参考沙门氏菌P125109(ACCESSION:AM933172、基因组大小为4685848 bp)对测序数据进行组装。
1.5.2 生物信息学分析 根据基因组流行病学中心网站中SeqSero2血清分型数据库和ResFinder4抗性基因数据库中的基因组信息建库，采用 CentOS 7.8系统服务器创建相应的血清分型数据库和耐药基因数据库，分析60株沙门氏菌的WGS 组装数据，分别得到血清分型和耐药基因携带结果。将WGS分型结果与常规血清分型结果进行比较，对结果有差异的进行再次常规血清分型验证。对 WGS检测的耐药基因，使用 identity>90.0%，coverage>90.0%的阈值运行命令，进行基因型与耐药表型进行对比分析[13]。
2.1 全基因组测序、组装结果 经Illumina测序平台测序和Trimmomatic软件质控后，共得到约77.59 Gb的原始数据，组装后的60株沙门氏菌的基因组大小在4648280～ 13443523 bp之间，GC含量为45.32%～52.24%，具体结果见表1。
表1 60株猪源沙门氏菌全基因组序列基本特征Table 1 The basic characteristics of whole genome sequence of 60 Salmonella strains from pigs
2.2 血清凝集分型与全基因组分型结果比较 60株沙门氏菌通过血清凝集试验共鉴定出8种血清型，主要血清型为鼠伤寒和德尔卑；
WGS分型共鉴定出9种血清型，优势血清型与常规血清分型结果一致；
两种方法共有54株分型结果一致，符合率为90.0%，具体分型结果见表2。
表2 常规血清分型与全基因组分型结果Tab 2 Results of routine serotyping and whole genome typing
2.3 药敏试验结果 沙门氏菌对11种抗菌药物的耐药性情况详见表3。结果表明，猪源沙门氏菌对不同抗菌药物的耐药情况差异较大，其中对美罗培南、头孢噻呋、阿奇霉素和粘菌素均为敏感，而对四环素、氨苄西林等7种抗菌药物均产生了不同程度的耐药性，尤其是对四环素(73.3%)的耐药水平明显高于其他抗菌药物。
表3 60株沙门氏菌对11种抗菌药物的耐药情况Tab 3 Antimicrobial resistance of 60 Salmonella strains to 11 antimicrobial agents
2.4 全基因组测序预测沙门氏菌的耐药基因型 基于60株沙门氏菌的WGS测序结果，使用抗性基因数据库ResFinder4分析获得的耐药基因包括β-内酰胺类(blaTEM-1、blaOXA-1)、四环素类(tetA和tetB)、磺胺类(sul1、sul2和sul3)、喹诺酮类(oqxA、oqxB和qnrS2)和酰胺醇类(floR)。
通过比较，WGS预测的沙门氏菌耐药性与药敏试验结果的符合率较高，其中对恩诺沙星、美罗培南、头孢噻呋和阿奇霉素预测的结果完全一致；
对氨苄西林、磺胺异噁唑、四环素预测的结果符合率均高于90.0%，对复方新诺明、氟苯尼考、阿莫西林/克拉维酸预测符合率也大于75%，具体结果详见表4。
表4 沙门氏菌药敏试验结果与全基因组测序结果的比较Tab 4 Comparison of antimicrobial sensitivity test results and whole genome sequencing results of Salmonella
随着全基因组测序技术和生物信息分析方法的不断进步，测序时间与成本的不断降低，使得公共数据库中存储了大量的病原菌基因组序列，极大提升了细菌基因组测序数据的准确性与可用性。与此同时，简便易用的在线数据分析与可视化工具也在不断问世，如血清分型数据库SeqSero2和耐药基因数据库ResFinder4，二者均可通过CGE网站直接上传WGS组装序列，即可预测相应的血清型和耐药基因，简便了操作流程[14-15]。
本研究利用SeqSero2分析获得的血清型结果与常规分型结果的符合率为90.0%，这与他人的研究结果基本一致。如BANERJI等[16]的研究中，WGS预测520株沙门氏菌血清型结果与原始分型结果的符合率为98.0%。DIEP等[17]研究的98株沙门氏菌的血清型与常规分型结果的符合率为98.0%。在两种分型结果不一致的血清型中，大部分是需要特殊培养基培养和多种血清鉴定的罕见血清型，如奥兰、奥兹马斯等。这可能是因为常规血清分型结果的判读会因个人判读标准不同而产生差异，亦或者是由于H相抗原基因中的等位基因在相变机制中发生突变而不表达而产生不一致的结果[18]。
为评估WGS在沙门氏菌抗菌药物耐药性中的鉴定能力，应用ResFinder4抗性基因数据库分析沙门氏菌所携带的耐药基因，从耐药基因的携带推断抗菌药物的耐药性来看，应用WGS预测的恩诺沙星、美罗培南、头孢噻呋和阿奇霉素的耐药性与药敏试验结果完全一致，对氨苄西林、磺胺异噁唑、四环素预测的结果符合率也均大于90.0%。ZANKARI等[19]通过WGS预测的49株鼠伤寒沙门氏菌基因型与表型药敏试验的结果完全一致。ZHU等[20]对189株沙门氏菌的耐药性检测中，WGS预测的磺胺异噁唑、氨苄西林和四环素的耐药性与其耐药表型的符合率分别为97.8%、94.6%和85.7%。NEUERT等[20]研究的3415株沙门氏菌对15种抗菌药物的表型耐药性与基因型耐药性结果的符合率为97.8%。目前WGS 只能检测到质粒介导的耐药基因，而对于染色体突变产生的耐药基因无法检出。在对阿莫西林/克拉维酸耐药基因型检测中，可能由于基因组测序过程中部分区域的覆盖率较低，阻止了突变位点的检测，亦或者出现了新的耐药基因突变，从而出现了表型与基因型的符合率相对较低的结果[21]。
基于全基因组数据分析的沙门氏菌血清分型和耐药性方法具有操作简便、效率高的优势，可以在常规血清凝集试验难以开展或沙门氏菌鞭毛基因不表达的情况下，替代血清凝集试验，也可快速识别菌株携带的所有耐药基因。为解决沙门氏菌耐药性问题提供重要参考，在沙门氏菌流行病学的研究中具有较高的应用价值。
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