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朱予津 高维 韩国敬 胡红
哮喘是一种异质性疾病，受遗传和环境因素的影响[1]。哮喘具有多种表型(Phenotypes)[2]。表型是指生物体基因与环境共同作用后被观察到的特征[3]。近年来哮喘的表型不断细化[4]，进而指导个体化治疗[5]。有时表型仍无法解释患者对药物的反应差异问题[6]。有学者认为，高达80%的哮喘患者对药物的反应差异是由遗传变异引起[7]。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)与患者哮喘的病情严重程度和易感性相关[8-11]。SNP也与药物疗效相关[12-13]。该领域的研究有助于揭示患者药物反应差异的遗传学特征，更好地指导个体化治疗[14]。本研究选择了目前研究相对成熟的9个影响哮喘药物疗效的相关基因SNP位点(见表1)进行研究，探索其在哮喘个体化诊疗中的价值。
一、研究对象
选择2017年1月1日～2019年4月1日于解放军总医院就诊的哮喘患者，共纳入患者98例(涵盖两种表型，其中嗜酸性粒细胞型哮喘患者90例，中性粒细胞型哮喘患者8例)；
选择542例健康人作为正常对照组。本研究已报备医院伦理委员会并批准(S2016-089-01)。
入组标准：年龄16～70岁，男女不限，行动不受限，能正确表达思想，未参加其它临床试验；
嗜酸性粒细胞型哮喘标准：诱导痰Eos≥3%且Neu≤61%；
呼出气一氧化氮(Fractional exhaled Nitric Oxide, FeNO)>25 ppb；
中性粒细胞型哮喘标准：诱导痰Eos<3%且Neu>61%；
排除标准：年龄未满16岁或超过70岁；
近1个月内有呼吸道感染史；
慢性肺部疾病、心脑血管疾病及肿瘤患者等；
无法完成肺功能及诱导痰检查者；
处于妊娠期或哺乳期患者；
选取健康对照组542人,入组标准(该组人群由诺禾致源测序公司提供)：年龄16～70岁，男女不限；
无慢性呼吸道疾病及哮喘、过敏性疾病，无肿瘤及心脑血管等慢性疾病史。
二、方法
采集哮喘患者临床信息：家族及个人过敏史、血常规、过敏原、总IgE、诱导痰、肺功能、FeNO、哮喘控制测试(ACT)评分、哮喘控制问卷(ACQ)等；
静脉采取外周血1mL，使用TANGEN生物公司的DNA提取试剂盒(DP348)提取外周血DNA；
选择与哮喘药物药疗效相关的9个基因的10 个SNP位点， ADRB2 rs1042713 A/G，FCER2 rs28364072 A/G， NR3C1 rs41423247 G/C，GLCCI1 rs37973 A/G， CRHR1 rs242941 C/A，CRHR1 rs1876828 C/T，ORMDL3 rs2872507 G/A，PDGFD rs591118 G/A，LTA4H rs2660845 A/G， CYP3A4 rs35599367 G/A进行引物设计；
利用Sequenom MassARRAY AssayDesign 3. 1 软件设计针对这10个位点的多重PCR特异性扩增引物和延伸引物(序列见表1)。利用MassARRAY检测突变位点；
利用Sanger测序对质谱信息进行验证。
三、统计学方法
利用病例-对照实验进行差异 SNP筛选；
统计学分析采用SPSS16.0统计软件；
卡方检验用于定性资料的分析，组间基因型分布以及基因型组合的比较采用卡方检验；
对于符合正态分布的数据采用均数±标准差(Mean±SD)，两组间采用独立样本t检验进行统计；
如不符合正态分布，使用非参数检验；
三组间比较用单因素方差分析；
P<0.05为有统计学意义。
一、哮喘组和正常对照组资料比较
本次研究纳入哮喘患者98例，其中嗜酸性粒细胞型哮喘90例，中性粒细胞型8例，全体患者中男性46例，女性52例；
正常对照组542例，其中男性261例，女性281例，哮喘组与正常对照组性别构成无统计学差异；
与中性粒细胞型哮喘患者相比，嗜酸性粒细胞型哮喘组FeNO、诱导痰中Eos%、哮喘家族史比例及过敏史比例更高(P<0.05)，基本特征(见表2)。
表2 哮喘患者与正常对照组基本特征
二、检出情况
98 例哮喘患者10个SNP位点的总判读成功率大于90%，其中最高100%，最低90.8%，符合MassARRAY检验交付标准；
98例哮喘患者中，按照检出纯合子风险基因为阳性标准，该研究共检出58例阳性患者(占比59.2%)携带纯合子突变型基因96个，其中ADRB2 rs1042713 AA型28例(31.5%)，FCER2 rs28364072 GG型9例(10.1%)，NR3C1 rs41423247 CC型1 例(1%)，GLCCI1 rs37973 GG型 23 例(25.6%)，ORMDL3 rs2872507 AA型10例(11.1%)，PDGFD rs591118 AA型2例(2.2%)， LTA4H rs2660845 AA型23例(25.6%)。
三、病例对照研究结果
哮喘患者CRHR1 rs1876828位点TC型基因发生频次显著高于对照组(P<0.05)，T型等位基因的发生频次显著高于对照组(P<0.05)，由于CRHR1 rs1876828 A>G突变病例数少，后续未进行变异与临床特征相关性分析；
FCER2 rs28364072位点AA型基因发生频次显著低于对照组(P<0.05)，A型等位基因的发生频次显著低于对照组(P<0.05)；
余位点各基因型及等位基因频次比较无显著差异。具体基因型分布(见表3)。
表3 各SNP位点在哮喘组和对照组间的基因型分布情况
四、哮喘患者FCER2 rs28364072 A>G突变与患者临床特征及生物标志物相关性分析
本研究检测出FCER2 rs28364072分型哮喘患者90例，其中AA型患者1例， AG型患者79例，GG型患者9例。
与等位基因为AA+AG的患者比较，等位基因为GG型的患者哮喘未控制比例、重症哮喘比例更高(P<0.05) ；
GG型较AA+AG型FeNO 更低(P<0.05)；
其它临床特征及生物标志物等无统计学差异(见表4、5)。
表4 FCER2 rs28364072 A>G突变与89例患者临床特征相关性分析
表5 FCER2 rs28364072 A>G突变与89例患者临床特征相关性分析
五、10个SNP组合对于患者用药风险基因检出的阳性率
本研究联合9个基因10个SNP分析，按照纯合子风险基因为阳性标准，该组合共检出58例阳性患者，阳性率为59.2%。
六、个体化诊疗实践探索
举例1：患者李XX 主诉：咳嗽伴胸闷气短8年，加重3天，既往规律使用丙酸氟替卡松/沙美特罗500ug 2/日+孟鲁司特钠治疗，ACT 12分，为“重症哮喘”患者。化验：血常规阴性；
过敏原：花粉，花生，油烟，中草药；
IgE：666 U/L；
肺功能：FEV135.8%，FEV1/FVC 36.1% ，PEF 33.2%，BDR(-)，FeNO 30ppb。结合其基因检测结果(见表6)，患者rs1042713为AA显示使用β2受体激动剂受益降低，但可能使用噻托溴铵有获益，鉴于患者与ICS相关位点也无优势基因型，我们在原有治疗基础上加用了噻托溴铵粉吸入剂 18ug 吸入 1喷/日，并给予奥马珠单抗375mg 1/2周，持续3个月，规律用药半年余后复查：
ACT 20分，肺功能：
FEV142.7%，FEV1/FVC 45.3% PEF 48%，BDR(-)， FeNO 25ppb。而后调整丙酸氟替卡松/沙美特罗为250ug 2喷/日+噻托溴铵粉吸入剂 18ug吸入 1喷/日，3个月后患者复查肺功能较前相仿，症状控制可。
表6 患者李XX基因检测结果
举例2：患者任XX 主诉：咳嗽、胸闷5年，加重1周，既往间断使用布地奈德/福莫特罗160ug 2喷/日，ACT16分。化验：血常规阴性；
诱导痰：Neu66%，Eos0%；
过敏原：无；
IgE:42U/L；
肺功能：FEV155.8%，FEV1/FVC 49.4%， PEF 43.5%，BDR(-)，FeNO 22ppb。患者基因检测结果(见表7)显示rs1042713为AA型，预示使用β2受体激动剂受益可能降低，使用ICS可能受益，我们停用了布地奈德/福莫特罗，使用地奈德吸入剂200ug 2喷/日，加用思力华能倍乐喷雾剂 5ug吸入 1喷/日，由于患者为中性粒细胞型哮喘，结合文献报道使用阿奇霉素治疗可能获益，我们加用了阿奇霉素胶囊0.25g 1粒/日，规律用药半年余后复查：
ACT 21分，肺功能：
FEV182.7%，FEV1/FVC 60.3%， PEF 75%，BDR(-) ，症状较前明显好转。
表7 患者任XX基因检测结果
一、SNP检测在哮喘研究中占有重要地位
支气管哮喘作为异质性疾病具有明显遗传倾向，文献中报道，超过1000个基因与哮喘相关[15-16]。哮喘的发病机制复杂，可分为遗传学机制、炎症机制、免疫机制等[17]。SNP研究在基因遗传学机制研究中占有重要地位，全基因组关联分析研究(Genome-Wide Association Studies，GWAS)对于识别、验证哮喘易感基因的SNP具有重要作用[18-19]。根据基因SNP所在位置分为编码区和调控区。作为调控区重要组成部分的启动子就像“开关”一样精准控制着基因的转录翻译，位于启动子区的SNP可以导致基因转录障碍，而位于外显子(编码区)的SNP则可影响氨基酸合成，间接影响蛋白质功能，而内含子区的SNP可能参与到连锁平衡机制[20]。
二、哮喘药物疗效与SNP的关系
药物-基因组学研究可以识别出具有风险基因型的患者，这为哮喘患者可能的用药疗效和副作用提供了科学依据[21]。本研究结合既往文献报道，选择了临床研究相对成熟的几个与药物疗效相关的SNP位点进行研究，对98 名哮喘患者进行了MassARRAY 质谱分析，利用药物基因组学提供的基因型信息，对部分患者给予了个体化治疗的指导。
1 β2肾上腺素能受体激动剂
β2肾上腺素能受体(β2 Adrenoceptors，ADRB2)rs1042713 G>A。
ADRB2 位于染色体5q31-32。ADRB2 作为鸟苷酸结合蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptors，GPCRs)成员在支气管上皮、黏膜下腺、细支气管平滑肌、肺动脉平滑肌、肺动脉内皮细胞和肺泡壁中均有表达。研究发现rs1042713基因型与哮喘未来加重风险相关[22]。
rs1042713位于基因启动子区，G>A变异(16，Gly-to-Arg)与基因表达相关[23]，且多项研究证实该变异与SABA治疗后肺功能峰流速变化相关[13, 24]。同GG基因型相比，携带AA基因型的哮喘患儿对沙丁胺醇或沙美特罗应答较低，使用长效β2受体激动药可增加哮喘恶化的风险[25-26]。一项研究利用计算机辅助设计模拟了rs1042713不同变异体与药物的结合程度，从而在机制上解释了不同变异体对于SABA药物反应的差异[27]。研究表明，与沙美特罗+吸入性氟替卡松治疗组比较，孟鲁司特钠+吸入性氟替卡松治疗组的AA基因型难治性哮喘患儿的哮喘控制更佳，肺功能改善更好[25]。另有研究认为，ADRB2 可预测抗胆碱能药物(噻托溴铵)的应答情况，在AA型应答率为61.9%，GA 、GG 基因型的应答率为25.4%[28]。目前，国内学者已有根据ADRB2基因分型进行用药指导的研究，对于β2受体激动剂应答效能低的患者可尝试使用抗胆碱能药物[29]。本研究中发现患者组AA纯合子的有28人，占总人群31.5%，预示着这些患者可能从β2受体激动剂治疗中获益降低。
2 糖皮质激素
(1)IgE受体Fc片段(Fc fragment of IgE receptor Ⅱ ，FCER2) rs28364072 A>G 。FCER2位于染色体19p13.2，负责编码IgE 受体(CD23)，通过影响B淋巴细胞周期影响IgE水平[30]。该位点接近外显子区域，可能通过剪切变异影响FCER2基因的表达，IgE受体(CD23)在C(hg37中为G)等位基因携带者中为低表达，受体激活后IgE水平升高。rs28364072不同基因型与ICS治疗后患者的IgE水平、哮喘急性发作率、FCER2表达有关[31]。有学者比较了该位点的三种基因型与FENO水平的相关性，结论显示不同基因型哮喘患者中FENO差异显著，AA型最高，GG型最低[32-33]。临床中高FENO水平预示着对ICS反应良好，因此，对ICS的反应GG型较差[34]。本研究中发现两组人群三种基因型频率具有统计学差异，哮喘组AA型基因发生频次显著低于健康对照组，本研究发现，携带GG基因患者共9例，占患者检出总数10.1%，预示着这些患者可能使用糖皮质激素的受益降低。在基因型与患者临床特征及生物标志物相关性分析中我们发现，GG型的患者哮喘未控制比例、重症比例更高(P<0.05) ；
GG型较AA+AG型FeNO 更低，与既往文献报道一致，预示着rs28364072基因检测对临床诊断及用药具有参考价值。
(2)核受体亚型3，C组成员1 (Nuclear Receptor subfamily3,group C, member 1, NR3C1) rs41423247 G>C 。
NR3C1 编码糖皮质激素受体(Glucocorticoid Receptor, GR)，位于染色体5q31.3，不同基因型与哮喘患者吸入糖皮质激素治疗后肺功能的改善相关[35]。有研究显示糖皮质激素抵抗可能与NR3C1 基因型相关[36]，不同基因型可导致基因转录活性以及蛋白表达产物活性的降低，间接影响ICS 的使用效果[37]。研究表明，哮喘患者使用高剂量的丙酸氟替卡松治疗后4 h，CC、CG 型FEV1%、血氧饱合度的改善比GG 型低，且哮喘人群中G 等位基因的分布频率高于正常人群[38]。本研究中发现患者组中CC型1人，GC型29人，该部分患者对吸入性糖皮质激素的效果可能弱于GG型。本研究哮喘患者中GG型分布同样高于健康对照组，但无统计学意义。
(3)糖皮质激素诱导转录蛋白1(Glucocorticoid Induced 1，GLCCI1)rs37973 A>G。GLCCI1基因位于染色体7q21.3，是一种蛋白质编码基因，ICS 可诱导该基因表达增加[39]。我国学者的研究证实rs37973基因型与糖皮质激素疗效及肺功能相关[40-42]。国外研究认为，携带GG型哮喘患者糖皮质激素反应差， GA 基因型居中，而AA型较好[43-44]。我国学者研究发现，布地奈德气雾剂对AA型患者更为理想、不良反应发生率低，而G等位基因则相对较差，该结论给哮喘控制较差的患者个体化给药治疗提供了参考依据[45]。本研究中发现患者组GG纯合子23人，占总患者25.6%，预示着这些患者糖皮质激素的治疗受益可能会降低。
(4)促肾上腺皮质素释放激素受体1 (Corticotropin Releasing Hormone Receptor 1，CRHR1)rs242941G>T及rs1876828 A>G。CRHR1基因位于染色体17q21.31，负责编码G蛋白耦联受体，对于激活影响下丘脑-垂体-肾上腺通路的信号转导通路至关重要。该基因参与内源性糖皮质激素的产生且会增加变应原诱导的气道炎症反应，可能会影响外源性糖皮质激素的疗效。药物基因组学研究发现CRHR1基因内含子上2个位点rs242941G/T(hg37中为C/A)及rs1876828 A/G(hg37中为C/T)与ICS 治疗8 周后的FEV1变化有关，rs242941 TT型吸入糖皮质激素效果是野生型的2倍，而rs1876828 AA(在hg37中为TT)型吸入糖皮质激素效果是野生型的4倍[46]。有学者使用贝叶斯高斯模型将两个SNP rs242941 和rs1876828 组合成FEV1变化的预测模型，发现两个SNP组合预测模型比单一突变有更高的准确性和可复制性，是预测激素疗效的生物标志物[47]。本研究中rs242941两组人群基因型频率无统计学差异，所有患者均未携带AA优势性突变，预示着本研究所有患者失去了吸入性糖皮质激素治疗的先天优势；
而rs1876828两组人群基因型频率具有统计学差异，未发现TT型优势性突变，但三例患者为TC型，可能从糖皮质激素治疗中获益更大。由于针对该突变患者病例较少，未能做基因分型与临床及生物标志物的相关性分析。
(5)神经鞘脂类蛋白3(ORMDL Sphingolipid Biosynthesis Regulator 3，ORMDL3)rs2872507A>G。
ORMDL3基因是哮喘的易感基因，它位于染色体17q21.1，可影响鞘磷脂的合成参与内质网介导的钙离子通路。研究显示，ORMDL3 rs2872507基因型与基因表达相关，欧洲一项研究显示，rs2872507与糖皮质激素效果治疗后的肺功能变化相关，AA 型使用ICS效果最优[48]。本研究发现携带AA基因患者共10例，占患者检出总数11.1%，预示着这些患者从吸入性糖皮质激素治疗获益的可能性更高。
(6)血小板源性生长因子(Platete-Derived Growth Factor D，PDGFD)rs591118 G>A。PDGFD位于染色体11q22.3，由于哮喘患者面临吸入性糖皮质激素和全身性糖皮质激素的使用，因此需关注患者的肾上腺功能抑制风险。据报道，规律吸入200mg/日的倍氯米松可诱导肾上腺功能出现抑制，1/3的哮喘患者使用激素后皮质醇峰浓度小于542 nmol /L[49]。除了哮喘，COPD患者使用ICS治疗也可能出现肾上腺功能抑制[50]。瑞典一项关于儿童和成人口服糖皮质激素的研究发现，口服泼尼松龙≥5 mg/日，21天即有肾上腺皮质功能不全的风险，据研究使用激素出现肾上腺皮质抑制的时间分别为1天到4周不等[51]。在一项队列研究中发现PDGFD基因内含子区SNP rs591118 G>A与肾上腺功能抑制相关，这一发现在儿童哮喘和成人COPD患者中均得到了验证，肾上腺抑制患者比例为GG型最低，AG型居中，而AA型最高[52]。本研究发现携带A A基因患者2例，占患者检出总数2.2%，预示着该两名患者未来肾上腺皮质抑制的可能性更高。
3 白三烯调节剂
白三烯A-4水解酶(Leukotriene A-4 Hydrolase，LTA4H)rs2660845 G>A。LTA4H 位于染色体12q23.1，可水解白三烯类药物。孟鲁司特钠是一种白三烯D4受体拮抗剂。研究显示，LTA4H rs2660845 AG和GG 型哮喘急性发作的概率较AA 型纯合子高4～4.5倍[53]。日本一项研究显示该SNP位点与使用孟鲁司特钠后FEV1% 和PEF%变化的相关，A A型肺功能改善高于G 等位基因携带者(A G + G G)[54]。本研究中发现携带AA基因患者共23例，占患者检出总数25.6%，预示着这些患者从白三烯类药物的获益较高。
4 药物-基因组学与药代动力学
药物代谢酶相关细胞色素P450家族3亚家族A成员4(Cytochrome P450 Family 3 Subfamily A Member 4，CYP3A4) rs35599367，C>T 。CYP3A4位于染色体7q22.1，是诸多肝脏中药物代谢酶的一种，可代谢多种药物。有研究分析了接受FP治疗的268例哮喘患者，对药物代谢酶CYP3A4、CYP3A7、CYP3A5中的9个SNP进行研究得出CYP3A4内含子突变rs35599367 C>T突变(hg37中为G>A)患者即CYP3A4*22携带者在哮喘控制方面较未突变者改善显著，但该受益等位基因的人群携带率较低，约占7%[55]。这种机制可能是变异与肝脏CYP3A4mRNA表达及酶活性的下降有关，导致活性FP长时间停留气道加强了药效，但这种影响依赖于吸入到循环中的药物总量[56]。本研究未发现携带AA基因型的患者，预示着所有患者失去了从该位点变异中的获益。
2013年发表于《柳叶刀·呼吸医学》上的一项研究通过对1000余人近40年的追踪随访，发现了多个基因位点组合可预测哮喘的发生、加重以及肺功能损害程度[57]。我们试图探索寻找出评估哮喘药物治疗效果的一组SNP位点组合，为哮喘患者，尤其是重症哮喘患者提供用药依据。目前已有地区根据药物基因组学的研究将个体化的治疗列入了哮喘治疗指南并应用于临床[58]，但国内外尚无联合SNP位点用于评估多种哮喘药物疗效的基因组合，本研究有助于为哮喘患者尤其是重症哮喘患者的药物个体化治疗提供帮助。文中仅通过两个例子说明了个体化治疗对治疗控制不佳的患者的可行性，通过结合患者基因分型，指导用药的实践，很多患者的疾病得到了较好的控制。未来期望药物-基因组学的研究加快理论向临床实践转化的步伐，以提高其预测评估药物治疗反应的准确性，让更多的哮喘患者从基因检测中获益。
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