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武娟娟 李建强
支气管哮喘(简称哮喘)是一种气道慢性炎症性疾病,糖皮质激素尤其是吸入激素联合长效β2受体激动剂是目前治疗哮喘的一线疗法,大部分患者通过规范化治疗可获得哮喘控制，但有5%～10%的患者对这些药物的反应不满意，导致哮喘症状难以控制，类固醇抵抗(SR)被认为是糖皮质激素治疗反应不佳的最重要原因，它们对医疗保健造成了不成比例的巨大负担。SR定义为在适当剂量的类固醇治疗2周后，1秒内用力呼气量 (FEV1)改善<15%[1]。
临床上目前缺乏准确预测哮喘患者类固醇反应性的生物标志物，诊断基于充分类固醇治疗后的临床病史和肺功能，这导致患者长时间接受高剂量的类固醇，直到认识到这对治疗无效。事实上，这些患者发病的一个关键原因来自长期高剂量类固醇的毒副作用。这些包括对感染、骨质疏松症、高血糖症和心血管疾病的易感性增加[2-3]，因此寻找能够预测类固醇抵抗性哮喘(SRA)的无创性生物标志物已成为研究热点。早期识别SRA患者有助于提供更有效的抗炎治疗，并避免与长期皮质类固醇治疗相关的潜在副作用。本文简要总结了目前预测SRA的几种生物标志物，例如：维生素D结合蛋白 (VDBP)，微RNA-21(miRNA-21)，磷酸化的p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK)和应激活化蛋白激酶1(p-MSK1)，血清OX40配体(OX40L)和胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)。
最近，人们对维生素D轴在肺病中的作用非常感兴趣，其中包括维生素D(VitD)、维生素D受体(VDR)和维生素D结合蛋白(VDBP)。许多研究表明哮喘和维生素 D 之间存在联系。维生素D是一种脂溶性维生素，除了对钙和磷酸盐的体内平衡有影响，越来越多的研究表明它还是一种复杂的免疫调节分子。维生素 D 水平通常通过血清25-羟基维生素D3 (25-(OH)-D3)水平来衡量；
因为这种形式的维生素 D 更稳定，而维生素 D 的活性形式 1,25-二羟基维生素D3(1,25(OH)2-D3)的半衰期较短。维生素D需要通过VDR介导发挥免疫调节作用[4]。多项研究发现1,25(OH)2-D3联合糖皮[]质激素不仅可以有效改善患者症状，还可以与糖皮质激素联合发挥抗炎效果，并能在较大程度上降低糖皮质激素的用药量[5]。在Bassam Mahboub等人[6]的实验中强调了 VitD 在SRA中的作用，类固醇抗性与糖皮质激素受体 (GR-β)的表达增加有关，糖皮质激素(GC)与细胞质中GR结合以及 GC/GR 复合物易位到细胞核中，在细胞核中GC/GR 复合物通过直接 DNA 结合或转录因子失活来修饰特定基因的转录。GR有两种变体，GR-α和GR-β，在 C 末端结构域有细微的剪接差异。GR-β不能与 GC 结合，因此不能转导GC诱导的功能。我们评估了维生素 D 缺乏的哮喘患者补充维生素 D 前后糖皮质激素受体GR-α和GR-β的表达水平。有趣的是，校正 VitD 水平通过上调 GR-α水平而不影响 GR-β水平来提高 GR-α/GR-β比率。总之，恢复 VitD 水平可通过增强 GR-α的表达来改善哮喘患者对类固醇治疗的反应。
VDBP是一种糖基化的球蛋白，它是白蛋白基因家族的一部分，与白蛋白具有多个二硫键连接的三重结构域结构[7]。几乎所有维生素 D 代谢物循环时都与 VDBP(对维生素 D 配体的高亲和力)或血清白蛋白(对维生素 D 配体的丰度高但亲和力低)结合。有研究发现，过量的VDBP会限制未结合的维生素D在细胞中的自由扩散，限制维生素D的活性，从而导致潜在的免疫后果。已有研究证明维生素D对哮喘患者具有抗炎和增强类固醇激素的作用，上述研究也表明维生素D不足可导致SRA的发生。另一方面，血清25-(OH)-D3的降低有可能会反过来影响血清VDBP，这可能会促进SRA患者血清VDBP的升高。目前机制尚不清楚，但这表明维生素D轴在SRA的发生和发展中发挥重要作用。
循环中只有5%的VDBP与维生素D代谢物复合，这使得相当数量的VDBP可用于其他功能。VDBP的另一主要功能与中性粒细胞趋化性和巨噬细胞活化有关[8]。最近的研究表明SRA的一种表型与中性粒细胞性炎症有关。在重症哮喘和SRA患者的血液循环和痰液中发现中性粒细胞增多。因此，我们推测血清VDBP升高诱导中性粒细胞募集，从而引起SRA患者中性粒细胞炎症和类固醇耐药性。此外，前期研究发现VDBP的另一重要功能是转化为巨噬细胞活化因子后诱导巨噬细胞活化。肺泡巨噬细胞是哮喘气道中最丰富的细胞类型，因此我们推测血清VDBP的增加可能通过激活SRA患者的巨噬细胞促进气道炎症的发生。由此我们推测，血清VDBP升高可能诱发SRA患者中性粒细胞炎症和巨噬细胞活化，可能在SRA的发病机制中参与了慢性气道炎症和SR的发生。在江洪娟等[9]的一项研究中，评估了类固醇敏感性哮喘(SSA)和SRA患者血清蛋白质组的差异， 发现SRA组血清VDBP水平显著高于SSA组和对照组，证实血清VDBP升高是SRA的危险预测因子。综上，血清 VDBP 可能是一种有用的非侵入性生物标志物，可以预测哮喘患者的类固醇抵抗。尽管目前针对该指标开展的临床实验相对较少，其在 SRA 患者中的作用未完全明确，临床尚未应用其评估哮喘患者是否存在类固醇抵抗，但有部分临床研究已证实VDBP 对 SRA 患者具有潜在的临床价值，故有必要进一步研究 VDBP 在 SRA 患者中的生物学机制。
非编码 RNA (ncRNA) 是非编码蛋白质的 RNA 转录物，特别是微RNA (miRNA)，由于它作为基因表达的关键调节因子的多功能作用，最近受到越来越多的关注[10]。miRNA 通常在转录后阶段，通过mRNA裂解和降解和/或通过抑制翻译，以序列特异性方式负调控基因表达[11]。越来越多的证据表明，miRNAs对肺发育和维持肺无病状态至关重要。在哮喘中研究最多的 miRNA 之一是 miRNA-21，对哮喘小鼠模型和哮喘患者的多项研究表明，miRNA-21 的上调负调节 IL-12p35、组蛋白去乙酰化酶 2 (HDAC2)，并正调节磷酸肌醇 3-激酶 (PI3K)，这可能会促进 Th2 细胞因子的表达增加并抑制 Th1 细胞因子的表达[12]。Th2/Th1失衡是哮喘重要的发病机制之一。
最近的一项研究表明，T淋巴细胞分泌的一种重要细胞因子IL-12，可能在哮喘发病机制中起重要作用。IL-12是一种来自巨噬细胞和树突状细胞的由IL-12p35和IL-12p40亚基组成的异二聚体细胞因子，也是先天免疫和适应性免疫之间的重要联系。有研究证实IL-12p35是miRNA-21的一个分子靶点，miRNA-21可以显著抑制IL-12转录后的翻译过程[13]。随着miRNA-21的表达增加会导致IL-12表达降低。IL-12在过敏原激发之前和期间阻止了过敏原诱导的气道嗜酸性粒细胞增多、气道高反应性、Th2细胞因子的产生和过敏原特异性血清IgE的产生，而它增加了干扰素-γ以及过敏气道浸润中CD4+T细胞凋亡增强。多项研究发现，miRNA-21 的上调可以负调节 IL-12p35，导致IL-12水平降低，限制其发挥免疫调节作用。
解释哮喘患者相对皮质类固醇耐药性的最重要机制之一是HDAC2降低。HDAC2属于HDAC家族，它主要位于细胞核内，可以阻止RNA聚合酶Ⅱ及转录因子与其上的转录位点相结合，在抑制炎性基因的转录和炎性蛋白的表达中起重要作用。之前的研究表明，糖皮质激素通过将HDAC2招募至炎性基因转录起始位点，使乙酰化的组蛋白去乙酰化，从而抑制炎性基因转录，使炎性因子表达降低。John A. Marwick等人[14]研究发现类固醇不敏感和HDAC2活性降低都与异常的PI3K活性有关。PI3Ks是参与调节细胞生长、代谢、增殖、葡萄糖稳态和囊泡运输的蛋白家族。miRNA-21可以下调磷酸酶和紧张素同源物(PTEN)的表达， PTEN通过催化磷脂酰肌醇3,4,5-二磷酸的去磷酸化，转化为磷脂酰肌醇4,5-二磷酸来拮抗PI3K活性，所以哮喘患者miRNA-21增加，PI3K活性增强，它的靶蛋白是AKT，AKT是一类高强度保守性的丝氨酸蛋白激酶物质及苏氨酸蛋白激酶物质。PI3K介导AKT的磷酸化和核易位，从而抑制HDAC2水平导致GR过度磷酸化，降低了由糖皮质激素诱导的各种抗炎基因的表达，从而降低了糖皮质激素的敏感性。Richard Y. Kim等人[15]研究中发现 miRNA-21 通过放大 PI3K 介导的 HDAC2 抑制来驱动严重的、类固醇不敏感的实验性哮喘，因此，抑制增加的 miRNA-21 或 PI3K 反应可抑制疾病并恢复类固醇敏感性。由此我们认为哮喘患者血清中高的miRNA-21可以预测类固醇不敏感。Elbehidy等人[16]的研究中同样发现，与SSA患者相比，SRA哮喘患者血清定量表达miRNA-21水平显著升高。Logistic回归分析评估miRNA-21是否能预测哮喘患者的吸入皮质类固醇(ICS)反应，结果示miRNA-21是ICS反应的独立预测因子。由此得出结论，miRNA-21 可以成为跟踪吸入性皮质类固醇治疗反应的有前途的生物标志物。
丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。在哺乳动物细胞中，有三个明确的MAPK通路:细胞外信号调节激酶(ERK)通路，JUN N-末端激酶(JNK)途径和p38途径。p38 MAPK与哮喘的气道炎症相关[17]。研究报道p38 MAPK的激活与皮质类固醇的反应性降低有关，糖皮质激素(GC)与糖皮质激素受体 (GR) 结合，后者从细胞质转移到细胞核中。GR与糖皮质激素反应元件 (GRE) 结合，并调节相关基因的转录，包括丝裂原活化激酶磷酸酶 (MKP-1)。MKP-1 是一种磷酸酶，可选择性地灭活磷酸化 p38 丝裂原活化激酶 (p-p38 MAPK)，从而抑制促炎细胞因子的产生[18]。据报道，在SRA患者中，IL-2和IL-4气道表达增强，IL-2和IL-4可诱导p-p38 MAPK。活跃的p38 MAPK造成过度 GR 丝氨酸 226 磷酸化，从而破坏GR的核易位和DNA结合，降低GR的活性，从而导致相对糖皮质激素抵抗[19]。此外，先前的研究表明，使用p-p38 MAPK 抑制剂，抑制p38 MAPK 通路激活可显着增强地塞米松 (DEX) 诱导的 SRA患者对 GC 的反应性。另一方面多项研究证实SRA的一种表型与中性粒细胞性炎症有关，p38 MAPK可上调多种促炎细胞因子(如IL-8、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等)和趋化因子的表达， IL-8 是一种中性粒细胞趋化剂[20]。p38 还可通过上调肺血管内皮细胞细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的表达，促进中性粒细胞释放TNF-α[21]，引起中性粒细胞流入哮喘患者气道，从而导致激素不敏感。最近的证据也支持p38 MAPK在严重哮喘患者SR中的关键作用。与激素敏感性哮喘相比，激素抵抗性哮喘患者外周血单个核细胞(PBMC)中p-p38 MAPK水平显著升高，导致直接p38 MAPK下游激酶应激激活蛋白激酶-1(MSK1)的磷酸化水平也升高。
MSK1是一种直接位于 p38 下游的激酶，可介导不同炎症基因启动子丝氨酸上组蛋白H3的磷酸化, 导致局部染色质松弛，诱导炎症基因转录。然而，糖皮质激素会抵消炎症基因启动子处激活的 MSK1 的募集，从而抑制 NF-κβp65反式激活和同时发生的组蛋白 H3 磷酸化。核因子 κB (NF-κB) 是参与免疫和炎症反应的多种基因转录的关键调节因子之一。NF-κB 是一种二聚体，包含一个 p65 和一个 p50 亚基，其中前者具有反式激活功能。NF-κβp65在S276位点被MSK1磷酸化对炎症基因表达的正常启动至关重要。GR 和 MSK1 相互作用的一个例子是 MSK1 主要定位在细胞核中，然而，激活的 GR 可以将MSK1从细胞核转移到细胞质中，从而抑制 MSK1 对其下游靶标的作用。有研究检测到激活的 MSK1 的增加与 SRA外周血单核细胞(PBMC)中p-p38 的增加平行，表明 MSK1 可能参与调节细胞类固醇反应。Ling-bo Li等人[22]研究也发现，与SSA患者相比，在来自SRA患者的PBMC裂解物中检测到显著更高的p-p38 和p-MSK1 水平。而SRA患者的 PBMC 中的 ERK 和 JNK 磷酸化并不显著或呈阴性，该数据表明p-p38和p-MSK1可作为预测类固醇抵抗性哮喘的生物标志物。
OX40 配体 (OX40L) 及其受体 OX40是肿瘤坏死因子受体超家族的成员[23]。OX40L主要表达于B淋巴细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞和巨噬细胞。OX40、OX40L在哮喘患者气道固有层表达增加，促进幼稚T细胞极化，产生大量Th2细胞因子，如IL-4、IL-5、IL-13。这些细胞因子诱导 B 细胞 (IL-4)、嗜酸性粒细胞浸润 (IL-5) 和杯状细胞增生 (IL-13) 的 IgE 类别转换。这些机制促使维持高IgE水平、炎症细胞组织浸润、嗜酸性粒细胞增多、粘液释放和平滑肌收缩，导致严重过敏症状[24]。哮喘患者外周血单核细胞 (PBMCs) OX40 和 OX40L 蛋白水平显著升高, 与 T 细胞增殖能力增强有关。气道固有层和 PBMC 中升高的 OX40L 可以释放到循环中，所以哮喘患者的血清 OX40L 升高。Su-li Ma等人研究[25]得出，哮喘患者的血清 OX40L 水平显著高于健康对照组，而SRA的血清 OX40L 水平高于SSA。ICS治疗降低了血清 OX40L 水平，SSA 中血清 OX40L 的降低比 SRA 更显著。研究证实了血清 OX40L 是 SRA 的独立风险预测因子。因此我们推测OX40L可能参与了糖皮质激素抵抗的发病机制。这些结果表明，血清OX40L可能是一种有用的无创便捷指标，可作为识别皮质类固醇耐药哮喘患者的生物标志物。但其中存在一些问题，针对该指标的大部分的临床研究为回顾性的，依赖于冷冻血清和医疗记录。目前需要进行大量的前瞻性研究来进一步证实血清 OX40L在SRA患者中的临床应用价值。
除此之外，在上述研究中，与 SSA 和对照组相比，SRA 患者的血清胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)水平显著更高，并且与血清 OX40L 呈正相关。TSLP 是一种由受损上皮细胞产生的细胞因子，可刺激树突细胞成熟并诱导 Th2 介导的炎症[26]。OX40L 参与 TSLP 驱动的特应性炎症和病理性 Th2 免疫反应。TSLP 可以激活树突细胞(DCs)并促进 T 滤泡辅助细胞从幼稚 CD4+T 细胞分化，这取决于OX40L[27]。因此，形成了 TSLP-DC-OX40L 通路，通过增加炎症细胞因子和减少 CD4+CD25+Treg 细胞来促进气道炎症和哮喘发病[28]。TSLP 可以诱导嗜酸性粒细胞趋化和延迟凋亡，表明其在过敏性炎症中的潜在作用。除了嗜酸性粒细胞炎症，TSLP还在中性粒细胞气道炎症中发挥作用[29]。最近的一份报告表明，TSLP 可能是哮喘皮质类固醇抵抗的重要因素。与健康对照相比，哮喘患者支气管肺泡灌洗液 (BAL) 中的 TSLP 升高， TSLP 可消除地塞米松对 ILC2 细胞中 2 型细胞因子产生的抑制作用诱导类固醇抵抗[30]。此外，Kabata H.等人[31]的研究也发现TSLP 可通过控制 STAT5 磷酸化和 BCL-XL 表达，在自然辅助细胞(NH细胞)中发挥皮质类固醇抵抗作用。同时，鉴于TSLP还位于OX40L的上游，我们推测TSLP也可作为预测哮喘患者类固醇反应性的血清标志物。
哮喘是研究最多的类固醇难治性疾病。SRA患者通常有持续的气道炎症、长时间的高剂量 ICS 治疗和不必要的副作用[32]。由于全球哮喘患病率的增加，SR 已成为一个具有挑战性的健康问题，从而导致高成本的哮喘护理。因此，寻找敏感的无创性生物标志物来早期识别 SRA 患者对于提供有效的个性化治疗和避免哮喘患者的相关副作用非常重要。本文总结了VDBP、miRNA-21、p-p38 MAPK和p-MSK1、OX40L和TSLP这些生物标志物作为哮喘患者ICS反应的预测因子，有助于决策和确定可能或不可能接受ICS治疗的患者。它会减少无效治疗，并使患者免受治疗失败的失望。
总之，虽然在一小部分哮喘患者中观察到糖皮质激素抵抗，但它代表了一个严重的临床和社会经济问题。在其他炎症性疾病(如慢性阻塞性肺疾病、类风湿性关节炎和炎症性肠病)中同样观察到类似的不敏感，发生率更高。因此需要有早期识别和筛选不敏感性的生物标志物，这样才能更好地研究哮喘中 GC 不敏感相关的多种机制可以为其他炎症性疾病提供可转移的知识。针对不同的机制尽早为类固醇反应不佳的患者找到有效的最佳治疗方案。
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