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邓小嫚，康琳玲，钟京琛，倪思铭，雷丹丹，彭拥军
（南京中医药大学附属医院 南京 210029）
脑卒中是我国目前发病率、致残率、致死率、复发率均较高的疾病之一，也是我国目前伤残调整寿命年的主要原因[1]。缺血性脑卒中的发病率占据脑卒中发病率第一位，约为87%[2]。脑卒中的发生目前认为是由于各种原因导致的脑组织缺血、缺氧进而发生坏死或软化，表现为脑组织损害及脑功能障碍。脑卒中患者常易罹患各种并发症，如癫痫、脑水肿、脑出血、卒中后抑郁、卒中后焦虑、卒中后便秘、卒中后尿潴留、肺部感染、尿路感染等，不仅危害患者身心健康，还增加经济负担[3]。脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）被定义为由于缺血、缺氧但尚未发生器质性坏死、仍具有可逆性的脑组织在恢复血液供应后产生的病情恶化[4]。CIRI引起的梗死可能是不可逆性的，这种损伤比永久性血管闭塞危害更甚，因此，为了提高脑卒中患者的生存率、降低致残率、改善神经功能及生活质量，探讨脑缺血有效疗法及其作用机制十分关键。
血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）是介于血液和脑组织之间对某些物质的通过具有选择性阻碍功能的动态界面，主要是由毛细血管内皮细胞、细胞间的紧密连接、周细胞以及星形胶质细胞末端足部构成[5]。BBB的结构和功能遭到破坏，是引起血管源性脑水肿，造成卒中患者脑组织损伤的重要原因之一。纹状体是大脑基底神经节主要组成部分，前期研究采用IgG免疫组化法测定脑组织中的IgG来反映BBB的通透性，发现纹状体是脑缺血再灌注期间BBB首先遭受破坏的区域[6]。水通道蛋白-4（Aquaporin-4，AQP4）是位于BBB两侧的一种双向水转运蛋白，被认为是调节脑组织水分子代谢最重要的水通道蛋白[7]，参与了脑水肿的发生发展。采用siRNA质粒可有效沉默AQP4在受损脑组织的表达，明显减轻脑水肿[8]。毛细血管内皮细胞是由紧密连接蛋白连接，而闭锁小带蛋白-1（zonula Occludens，ZO-1）是参与紧密连接即血脑屏障的构成的重要结构之一，对稳定内皮细胞连接起着重要的枢纽作用。研究表明，ZO-1蛋白水平的变化与BBB的损伤程度具有高度相关性。脑缺血再灌注损伤发生后，相关蛋白表达的变化致使BBB的超微结构及通透性发生改变，从而引起脑水肿，导致神经细胞的损伤及凋亡。
祖国医学常采用针灸“水沟穴”和“百会穴”治疗缺血性中风，有着显著疗效及独特优势[9]。电针疗法是在针灸的基础上进行低频脉冲电刺激，近年来，电针被报道[10]可以通过改善脑卒中患者血脑屏障的通透性、改善微循环、治疗缺血性中风，但其作用机制仍尚不明确，可能与AQP4、ZO-1的表达存在联系。因此，本研究制作了大鼠脑缺血再灌注损伤模型，探讨电针后BBB通透性与AQP4、ZO-1表达的关系，以期为电针治疗脑缺血再灌注损伤引起的血脑屏障损伤及脑水肿提供科学的依据。
1.1 实验动物及分组
健康的雄性SD大鼠（6-8周龄，210-230 g）由南京中医药大学SPF级实验动物中心提供。根据随机数字表法，本实验将SD大鼠随机分为5组：正常对照组（NC）、MCAO模型组（M）、电针组（EA）、AQP4 siRNA组（siRNA）和空载质粒组（EP）。根据再灌注6 h、12 h、24 h、48 h和72 h这5个时间点将大鼠分别处死，并分为5个亚组。所有大鼠均置于于室温（22-25℃）中饲养，自由饮食。每种实验方法每个时间点选取大鼠6只。
1.2 实验方法
1.2.1 MCAO模型建立
根据改良后的Longa线栓塞法[11]，制作急性脑缺血再灌注(MCAO)模型。采用10%水合氯醛（0.36 mL/100 g）腹腔注射将大鼠进行麻醉，用高速颅骨钻于大鼠后囟钻取一合适小孔，将激光多普勒血流仪（LDF）插入小孔内，探头插至大鼠皮层表面，监测脑血流5 min，记录的脑血流为缺血前的基础值。随后将大鼠以仰卧位固定在操作台上，在其颈正中做一长度合适的切口，剥离血管及其周围神经，将分离出来的右翼腭突动脉用微动脉夹仔细夹闭，然后再分别夹闭大鼠的右颈外动脉、颈总动脉、颈内动脉。于右颈外动脉处用显微外科剪剪一小口，将直径0.18 mm 4-0号尼龙外科手术缝合线由此切口插入右颈内动脉，撤去微动脉夹，插至颅内，插入的深度约18-20 mm，此时有明显的阻力感，即到达大脑中动脉入口，撤去颈总动脉和翼腭突动脉上动脉夹。此时，LDF监测的脑血流量骤然下降至造模前15%以下[11]，大鼠脑缺血模型即构建成功，1 h后，将尼龙线撤至颈外动脉处时，为脑缺血再灌注的开始。
1.2.2电针干预
EA组于脑缺血5 min时进行针刺，使用0.25×15 mm的华佗牌毫针，刺入大鼠的“水沟穴”（GV26）和“百会穴”（GV20），然后接G6805-Ⅱ型电针治疗仪（上海医用电子机械有限公司，上海）。参数设置为：疏密波：密波频率为6.25 Hz，持续2.08 s；
疏波频率为3.85 Hz，持续1.28 s，电流强度为0.8-1.3 mA，时间30 min。
1.2.3右侧脑室给药
将siRNA组与EP组大鼠备皮后以仰卧位固定于操作台上，在脑立体定向仪的指导下，于矢状线旁约1 mm及冠状线后约1.5 mm处穿刺右侧脑室[12]，进针的深度定为1.5 mm。脑缺血后5 min，采用高速颅骨钻于大鼠右侧脑室注射部位正上方钻穿颅骨，然后插入微量注射器，分别向siRNA组和EP组大鼠右侧脑室缓慢注入已经配置好的AQP4 siRNA表达质粒和不含AQP4 siRNA的空载质粒，注射量为10µg（10µL）。操作结束后，于注射部位擦少许骨蜡，并且缝合外皮，即完成给药。
1.3 检测方法
1.3.1大鼠神经功能缺损评分评定
参考改良的Zea Longa 8级神经功能缺损评分法对大鼠进行神经功能评分[12]。见表1。
表1 神经功能缺损评分
1.3.2 CV染色法
本实验将各组大鼠断头取脑后，提取其脑组织，每只大鼠每隔12张取1张脑片，共取18张。采用CV染色法进行染色，主要通过脱水、复水、染色、分色及脱水、透明、封片等6个具体步骤完成。然后采用梯形公式，利用图像分析和处理系统（Q5701W，Leica，German）及其软件来测定每一张脑片缺血侧及其对侧的面积。公式如下所示：
V=1/2（S1+S2+S2+...Sn-1+Sn-1+Sn）×30×间隔张数
缺血侧脑半球的肿胀百分比=（V缺血侧-V对侧）/V对侧×100%
1.3.3 Western blot
采用Western blot方法检测各组大鼠右脑纹状体中AQP4和ZO-1蛋白含量的表达情况[13]。分别于大鼠脑缺血再灌注6 h、12 h、24 h、48 h和72 h这5个时间点处死大鼠，并提取大鼠脑组织，参照上述文献的方法进行实验。
1.3.4 RT-PCR
大鼠新鲜脑组织取材后，分离出右侧纹状体，按照TRIzol法提取大鼠总RNA，根据Promega公司提供的逆转录试剂盒说明书成功逆转录为cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR。用2.5%（w/v）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，灰度值用Syngene SYDR-1990系统（Amersham）测定，用目的条带与β-actin的灰度值的比值作为靶基因的表达，A部分及B部分引物序列如下图所示。见表2。
表2 引物序列
1.4 统计学方法
采用SPSS 22.0软件进行统计分析，若计量资料符合正态分布，用均数±标准差（±s）进行描述，若不符合则进行秩和检验。多组间比较采用单因素方差分析或秩和检验，若两组间比较方差齐时采用LSD法，若方差不齐则采用Dunnett T3方法；
并且采用Person相关分析。若P＜0.05，则认为差异有统计学意义。
2.1 电针改善神经功能
与NC组相比，M组与EP组大鼠神经功能缺损程度较重（P＜0.05），与M组及EP组相比，EA组及siRNA组大鼠神经功能缺损程度较轻（P＜0.05），而M组与EP组神经功能缺损评分表达无明显统计学差异（P＞0.05），EA组及siRNA组神经功能缺损评分表达无明显统计学差异（P＞0.05）。见表3。
表3 各组大鼠不同时程神经功能缺损评分比较（±s,n=30）
表3 各组大鼠不同时程神经功能缺损评分比较（±s,n=30）
注：与M组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
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2.2 电针改善大鼠脑缺血再灌注损伤后脑水肿和脑梗死
各组大鼠采用CV染色后，可发现M组与EP组大鼠于脑缺血再灌注6 h时发生肿胀，且逐渐加重。与M组相比较，EA组及siRNA组大鼠肿胀率于再灌注24 h、48 h、72 h具有显著性差异（P＜0.05）。见表4。且M组大鼠CV染色后，可见大鼠脑组织出现明显的白色梗死灶（图1），CV染色法用于测量脑梗死灶较传统的TTC染色分布更直观，测量数据更精准。
图1 M组大鼠缺血再灌注24 h CV染色
表4 各组大鼠脑水肿引起的脑半球肿胀率比较（%,±s,n=30）
表4 各组大鼠脑水肿引起的脑半球肿胀率比较（%,±s,n=30）
注：与M组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
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2.3 电针有效下调AQP4蛋白和上调ZO-1蛋白的表达
与NC组 相 比，M组、EP组、EA组 及siRNA组AQP4蛋白均于12 h开始明显表达，逐渐上升，且M组和EP组AQP4蛋白的表达明显高于EA组及siRNA组（P＜0.05），其中M组和EP组AQP4蛋白的表达无统计学意义（P＞0.05），EA组及siRNA组AQP4蛋白的表达无统计学意义（P＞0.05）。见图2。
图2 各组大鼠不同时程AQP4蛋白的表达情况
随着脑缺血再灌注的进展，M组、EP组、EA组及siRNA组ZO-1蛋白的表达均显著下降，且M组、EP组ZO-1蛋 白 的 表 达 显 著 低 于EA组 和siRNA组（P＜0.05）。其中M组和EP组ZO-1蛋白的表达无明显统计学差异（P＞0.05），EA组及siRNA组ZO-1蛋白的表达无明显统计学差异（P＞0.05）。见图3。
图3 各组大鼠不同时程ZO-1蛋白的表达情况
2.4 电针有效下调AQP4 mRNA和上调ZO-1 mRNA的表达
M组、EP组、EA组及siRNA组大鼠AQP4 mRNA均于12 h开始显著表达，逐渐上升，且M组和EP组AQP4mRNA的表达明显高于EA组及siRNA组（P＜0.05），其中M组和EP组AQP4mRNA的表达差异无统计学意义（P＞0.05），EA组及siRNA组AQP4mRNA的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4。
图4 各组大鼠不同时程AQP4 mRNA相对含量的变化
随着脑缺血再灌注的进展，M组、EP组、EA组及siRNA组ZO-1mRNA的表达均显著下降，且M组、EP组ZO-1mRNA的表达显著低于EA组和siRNA组（P＜0.05）。其中M组和EP组ZO-1mRNA的表达差异无统计学意义（P＞0.05），EA组及siRNA组ZO-1mRNA的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5。
图5 各组大鼠不同时程ZO-1 mRNA相对含量的变化
2.5 大鼠神经功能缺损评分与脑水肿肿胀率、AQP4及ZO-1表达的相关分析
采用Pearson相关分析比较在缺血再灌注24 h时M组、EP组、EA组及siRNA组各组大鼠神经神经功能缺损评分与脑水肿肿胀率、AQP4及ZO-1表达的相关性，结果表明，大鼠神经神经功能缺损评分与脑水肿肿胀率呈现正相关（r=0.673，P＜0.05），与AQP4的表达呈现正相关（r=0.618，P＜0.05），与ZO-1的表达呈现负相关（r=-0.635，P＜0.05）；
AQP4与ZO-1的表达呈现负相关（r=-0.716，P＜0.01）。
血脑屏障是人体外周循环与中枢神经系统（central nervous system，CNS）之间重要的物理及生化屏障，主要维持CNS内环境的相对稳定性[14-15]。BBB是主要由内皮细胞和紧密连接构成的具有选择性阻碍作用的保护性屏障，可以有效阻止有害物质进入脑组织。脑缺血再灌注过程中血脑屏障的结构和功能遭到破坏，导致细胞旁通透性发生改变，引发脑水肿，其发生的分子水平机制尚不清楚，但可能与氧化应激、酸中毒、钙离子超载、免疫功能损伤、线粒体功能障碍、细胞毒性以及炎症反应等密切相关[16-17]。AQP4是位于BBB两侧介导水分子运动的水通道蛋白[7,18]，可通过影响BBB的完整性促进脑水肿的产生与消退[19]。BBB的完整性还与内皮细胞紧密连接的磷酸化水平有关，紧密连接是以Claudin蛋白为主由多种紧密连接蛋白构成的具有选择性渗透的结构[20]，而ZO-1是紧密连接复合体中的一种十分重要的跨膜蛋白，通过肌动蛋白细丝，稳定内皮细胞连接，起着重要的枢纽作用。研究表明，ZO-1蛋白含量的变化与BBB损伤密切相关[21]。研究发现，大鼠脑缺血再灌注12 h时，在缺血侧纹状体最先染色。纹状体区的BBB较易受到破坏，故我们采用大鼠右脑纹状体来研究急性脑缺血再灌注后AQP4、ZO-1的表达情况。Taniguchi等[22]研究发现，AQP4 mRNA含量在MCAO第1天有微弱的上调，第3天达到高峰，持续7天左右减少，与水肿形成及消退的变化呈平行关系。前期通过实验证实，大鼠脑缺血后脑水肿规律与临床上脑水肿规律基本一致，缺血再灌注6 h开始发生脑水肿，于再灌注72 h最严重，与临床上脑缺血急性期的症状表现相吻合，故本实验选择再灌注6 h、12 h、24 h、48 h和72 h这5个时间点进行进一步的观察研究[6]。
针灸治疗脑卒中的疗效显著，“水沟穴”和“百会穴”均是奇经八脉的督脉上的穴位，督脉入属于脑，总督一身之阳气，为阳脉之海。因此，针刺“水沟穴”及“百会穴”具有补脑益髓，醒神开窍之功效。电针疗法是传统针灸疗法与低频脉冲电刺激相结合的一种新型疗法，可以标准化和客观测量。当需要强刺激时，如治疗脑卒中引起的瘫痪时，电针可能比传统针灸疗效更佳。研究显示，电针不仅可以改善血液流变学和脑循环[9]，还可以降低血脑屏障通透性和脑水肿[23]，还能促进脑血管生成和神经生成[24]。Zhang等[25]发现电针“百会穴”（GV20）和人中穴（GV26）可以提高脑缺血再灌注大鼠血脑屏障通透性，且与针刺时间有关。田健材等[26]通过实验发现电针“水沟穴”可通过降低AQP4的表达减轻脑水肿，保护缺血性脑卒中大鼠脑组织的神经血管单元。前期的研究证明，脑缺血再灌注损伤与AQP4的表达上升关系密切，电针可有效地抑制AQP4蛋白和mRNA的表达，从而改善血脑屏障损伤，保护脑组织[27-28]。还通过实验证实电针人中、“百会穴”可通过有效抑制ZO-1蛋白的减少改善血脑屏障损伤，缓解脑水肿[29]。Jung等[30]也发现电针预处理缺血性脑卒中小鼠可显著减少AQP4的表达，增加紧密连接蛋白ZO-1和claudin-5的表达，从而降低脑梗死几率，促进神经功能恢复。
本实验通过制作脑缺血再灌注模型，发现除NC组外，其余四组大鼠均于脑缺血再灌注6 h时发生肿胀，且逐渐加重，AQP4均于缺血再灌注12 h开始显著表达，并逐渐上升，ZO-1均于缺血再灌注12 h开始显著下降。电针可上调AQP4的表达，下调ZO-1的表达，且随着时间的进展，AQP4的表达逐渐上升，ZO-1的表达逐渐下降，与siRNA抑制剂作用相似。通过相关分析还发现，神经神经功能缺损评分与AQP4的表达呈正相关，与ZO-1的表达呈负相关，与以往研究相比，我们认为脑缺血再灌注损伤过程中AQP4与ZO-1的表达呈负相关，电针通过有效抑制AQP4的上升及ZO-1的下降，改善血脑屏障损伤，减缓脑水肿，保护脑组织。我们推测，采用AQP4的抑制剂或ZO-1兴奋剂或通过信号转导机制对脑卒中患者进行早期干预治疗，则可能通过减少BBB中水分子转运，从而达到缓解脑水肿的目的，采用电针疗法可能成为治疗脑缺血再灌注损伤的一条新思路。本研究的创新性在于采用了改良的大鼠脑缺血再灌注模型制作方法，缺血效果确切可靠，稳定性好，手术时间短，远优于传统的方法。而且，我们采用了CV染色法用于显示MCAO造模后脑梗死灶的分布及脑水肿情况，较以往的TTC染色法分布更直观，不但节省了实验动物的数量，保护了实验动物的福利，而且降低了实验过程中的测试误差，提高了实验数据的准确性。但是本研究仍存在局限性，由于组数有限，侧脑室注射损伤未被排除。
综上所述，我们推测，大鼠神经神经功能缺损评分与脑水肿肿胀率呈正相关，与AQP4的表达呈正相关，与ZO-1的表达呈负相关，脑缺血再灌注损伤过程中AQP4与ZO-1的表达呈负相关。调控AQP4、ZO-1的表达可能是电针“水沟穴”、“百会穴”治疗脑缺血再灌注引起脑水肿及血脑屏障损伤的关键机制，有效地抑制AQP4的上升和ZO-1的下降可能成为脑卒中治疗的新靶点。电针治疗脑缺血再灌注损伤疗效已被证实，未来可进一步探讨电针对内皮细胞-星形细胞-周细胞共培养系统的作用机制[31]，还应该关注电针刺激频率和刺激强度对AQP4、ZO-1蛋白和mRNA表达能力的影响，为电针治疗脑缺血再灌注损伤寻找最合适的针刺时机和刺激量。
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