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赵 勇，雷湘兰，蔡仁教，王 相，肖海燕，郭利芳
（海南职业技术学院 热带农业技术学院，海南 海口 570216）
果酒中的多酚、多糖、有机酸等抗氧化成分赋予果酒特定的抗氧化活性，因而适量饮用果酒可以提高机体的抗氧化能力从而降低氧化应激对机体造成的伤害，有报道指出饮用果酒对机体的保健作用主要是由于其中丰富的多酚类物质的抗氧化作用[1-4]，多酚类物质必须是生物可利用的状态才能发挥生物活性，而生物可利用状态受到多酚类物质的释放、稳定性以及被机体的吸收利用情况因素的影响[5-6]，大部分酚类物质处于结合状态，因而其生物活性较低。要全面评估任何一类植物化学物的生物利用度，必须考虑其药代动力学特性，例如吸收、代谢、组织和器官的分布以及从体内排泄，然而在临床或体内进行这样的研究是复杂的，技术上困难并且昂贵，因而体外模拟消化是研究人员常用的方法。CELEP E等[7]对蓝莓酒、黑桑葚酒、樱桃酒在模拟胃肠液下的多酚物质及抗氧化活性进行研究，发现所有样品中的酚类物质含量在模拟胃肠液消化后含量下降，同时对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力、H2O2清除率以及总抗氧化活性都降低。YANG H等[8]研究得出，海红果果酒中对DPPH、超氧阴离子和羟自由基有很强的清除活性，其中邻二酚和双酚是主要的抗氧化活性成分。ČAKAR U等[9]研究发现，发酵前添加纤维素酶和糖对几种果酒（蓝莓、黑莓、覆盆子和酸樱桃）的α-葡萄糖苷酶的抑制作用有不同的影响，其中蓝莓和黑莓果酒具有最高的抑制活性，其中酚类物质中的绿原酸和咖啡酸被认为是重要的活性成分。YANG H等[10]报道海红果果酒中的芦丁、儿茶素、表儿茶素、柚皮苷、二氢查耳酮、β-甾醇可以显著提高高脂血症小鼠体内的脂代谢，增加高密度脂蛋白、降低血黏度、抑制小鼠肝脏中血小板的聚集和脂肪的蓄积。LIANG L H等[11]研究发现，桑葚中提取的花青素在模拟胃肠液下反应后生物可利用度、回收率都下降，但抗氧化活性提高。
蓝莓果酒是以蓝莓为原料经过一系列处理后发酵而成的富含有机酸、氨基酸、多糖、多酚、维生素等功能性成分的酒精性饮料。大量研究表明，蓝莓果酒具有较高的抗氧化活性[12-15]，乳酸菌、酵母菌富硒后具有更好的生物活性及发酵特性，并且其发酵的产品风味、抗氧化等功能特性更好[16-20]，但有关富硒酵母发酵蓝莓全果果酒的抗氧化活性及其体外消化特性鲜见报道。本研究采用添加亚硒酸钠制作的富硒酵母发酵蓝莓全果果酒，通过体外模拟胃肠液反应的方法对富硒蓝莓全果果酒在胃肠液消化后的酚类物质含量和抗氧化性能进行分析，为评价富硒蓝莓全果果酒经胃肠消化后的生物活性，进一步说明富硒蓝莓果酒的体内抗氧化等功能特性提供理论基础，为开发功能性更强的蓝莓果酒提供参考。
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料和菌株
蓝莓：市售；
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）JK10：烟台帝伯仕有限公司。
1.1.2 化学试剂
焦亚硫酸钠（分析纯）：安庆新亚菱化工有限公司；
碳酸氢钠、碳酸钠、磷酸、甲醇（均为分析纯）：成都科龙化学试剂厂；
福林酚、邻苯三酚、2,2"-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2,2"-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS）自由基（均为分析纯）：索莱宝（北京）有限公司；
DPPH、对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（p-nitrophenyl-D-galactopyranoside，pNPG）（均为分析纯）：美国Sigma公司；
胃蛋白酶（酶活3 000 U/L）、胰酶（250 U/L）、胆盐（分析纯）：生工生物工程（上海）股份公司；
没食子酸、绿原酸、咖啡酸、香草醛、对香豆酸、芦丁、槲皮素（纯度均＞98%）、α-葡萄糖苷酶（酶活0.4 U/mL）：上海源叶生物科技有限公司。
1.1.3 培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基：蛋白胨20 g，酵母粉10 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.0，115 ℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
CP114电子天平：奥豪斯仪器有限公司；
HY-2恒温水浴调速多用振荡器：上海跃进仪器有限公司；
Stratos低温高速离心机、U3000高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC）：美国Thermo Fisher公司；
FE28 酸度计：梅特勒托利多（中国）有限公司；
UV-1100紫外/可见分光光度计：上海MAPADA公司。
1.3 试验方法
1.3.1 富硒蓝莓全果果酒加工工艺流程及操作要点
操作要点：
预处理：将蓝莓清洗干净、晾干，打浆机打浆，得到蓝莓全果浆。
调配：加入白砂糖调整初始糖度为20°Bx，加入50 mg/L焦亚硫酸钠，搅拌均匀。
酵母活化及富硒：在5%糖水中36 ℃活化30 min得到活化酵母菌，酵母按照4.5%接种于亚硒酸钠质量浓度为50 μg/mL的YEPD培养基中25 ℃发酵90 h，即得富硒酵母。
接种：活化酵母或富硒酵母按照4.5%添加量加入上述调配后的蓝莓全果浆中。
发酵：装罐封口发酵（25 ℃，7 d），当酒精度和还原糖含量基本保持稳定时终止发酵。
过滤：发酵完成后用滤布滤去酒渣，得到滤液。
陈酿：滤液16 ℃下陈酿1～2个月，即得富硒蓝莓全果果酒成品。
1.3.2 模拟胃肠液制备[7，11，21]
模拟胃液：称取1.6 g胃蛋白酶，1.0 g氯化钠，溶解在500 mL去离子水中，用0.1 mol/L盐酸将pH调为2，0.45 μm滤膜过滤备用。
模拟肠液：称取磷酸二氢钾6.8 g，胆盐12.5 g，胰酶2.0 g，溶解在500 mL去离子水中，用0.2 mol/L碳酸氢钠溶液调pH至6.8，0.45 μm滤膜过滤备用。
1.3.3 体外胃肠液模拟消化反应[7，11，21]
胃液环境模拟反应：取5 mL酒样加入模拟胃液35 mL混合均匀后，37 ℃、100 r/min水浴摇床振荡反应1.0 h、3.0 h后取样进行多酚含量及抗氧化活性测定，反应完成后置于冰水中终止反应。
肠液环境模拟反应：在上述模拟胃液反应液中加入0.1 mol/L NaHCO3，调节pH为7.0，加入5 mL配制好的模拟肠液，37 ℃、100 r/min水浴摇床振荡反应0.5 h、1.0 h后取样进行多酚含量及抗氧化活性测定，反应完成后置于冰水中终止反应。
1.3.4 抗氧化性检测
西达里亚油田属于碎屑岩油藏。2005年以前，油田开发主力层位集中在上、中、下油组。2005年至2011年，技术人员发现新的油藏层系阿4段，但由于当时认识不到位，该层系仅用来采取零星补孔及合采措施。
羟自由基、超氧阴离子自由基清除能力测定：按照文献[8]中方法进行；
DPPH清除能力测定：按照文献[11]中方法进行；
ABTS清除能力测定：按照文献[22]中方法进行。
1.3.5 α-葡萄糖苷酶抑制活性[9]
用0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.8）配制α-葡萄糖苷酶（0.4 U/mL）、对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（pNPG）溶液（10 mmol/L）。200 μL样品溶液与200 μLα-葡萄糖苷酶溶液混匀，37 ℃下反应15 min后加入200 μL pNPG溶液，37 ℃反应10 min，加入1 mL碳酸钠溶液终止反应。在波长405 nm处测定吸光度值，α-葡萄糖苷酶抑制率计算公式如下：
其中：As为样品组的吸光度值；
Ac为对照组，即磷酸缓冲液代替样液且不加α-淀粉酶溶液的吸光度值；
Ab为空白组，即磷酸缓冲溶液代替样液且加入α-淀粉酶溶液的吸光度值。
1.3.6 总多酚的测定[23]
取1mL样品加入0.1mol/L福林酚试剂5 mL，充分混匀的加入7%Na2CO3溶液15 mL。然后立即将溶液稀释到25 mL，室温静置2 h，在波长750 nm处测定吸光度值，以没食子酸质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制没食子酸标准曲线，得到标准曲线回归方程：y=0.138 0x+0.025 3，相关系数R2=0.997 3。按照回归方程计算样品中总多酚含量，最终结果以mg没食子酸当量（gallic acid equivalent，GAE）/mL表示。
1.3.7 酚酸的测定[7]
酚酸采用HPLC法进行检测，其色谱条件如下：使用XDB-C18分离柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），柱温25 ℃，二极管阵列检测器，流动相：A相为10 mmol/L磷酸溶液，B相为甲醇；
洗脱程序：进样量10 μL，流速1 mL/min，0～15.0 min（0～60%B），15～20 min（60%～80% B），20.0～22.0 min（80%～100%B），22～27 min（100%～0B），27～32 min（0B）。与标准品出峰时间对比进行定性，通过峰面积进行定量分析。
采用Sigmplot 10.0作图，利用SPSS 17.0软件进行显著性分析，P＜0.05表示差异显著，结果以“平均值±标准差”表示。
2.1 富硒蓝莓全果果酒模拟胃肠液消化后总多酚含量
以非富硒酵母发酵蓝莓全果酒为对照，富硒蓝莓全果果酒在模拟胃肠液消化后总多酚含量测定结果见表1。由表1可知，两种酒样中的总多酚都随着模拟胃肠液的消化下降，随着消化时间的延长而下降，这与有关的研究报道结果相一致[7，21]。富硒蓝莓全果果酒和对照果酒中的总多酚在模拟胃液消化1.0 h后分别较未消化时下降5.04%、8.59%，3.0 h后下降10.44%、12.31%，样品下降的程度低于对照，由于样品中经过富硒酵母发酵后多酚含量本身较高，同时富硒酵母发酵后酒体具有更强的耐受胃液等环境的能力，因而总多酚在模拟胃液消化中含量始终显著高于对照（P＜0.05）。在经过肠液消化后两种酒体中总多酚含量进一步下降，模拟肠液消化0.5 h和1.0 h后样品和对照中的总多酚含量分别下降16.07%、23.57%、20.90%、29.58%，样品中下降的幅度小于对照，可能与本身较高的多酚含量有关，也可能与酒体中的硒有关，同时富硒酵母本身对氧化应激、极低pH、酶等环境的适应能力增强，由其发酵的酒体对胃肠液的酸性环境及酶的消化具有一定的耐受能力。与相关报道的结果类似[7]。
表1 两种蓝莓全果果酒模拟胃肠液消化前后总多酚含量测定结果Table 1 Determination results of total phenolic contents in two kinds of whole blueberry fruit wine before and after simulated gastric and intestinal fluid digestion mg GAE/mL
2.2 富硒蓝莓全果果酒模拟胃肠液消化后抗氧化活性
2.2.1 DPPH自由基清除活性
DPPH自由基是一种以氮为中心的有机自由基，在波长517 nm处有强吸收，当样品中有抗氧化剂时，自由基的孤对电子会被配对，吸收则会减弱，溶液颜色变浅，吸光度值也会减小，吸光度值的大小可反映样品的抗氧化活性强弱。以非富硒酵母发酵蓝莓全果果酒为对照，富硒蓝莓全果果酒样品经过不同胃肠液消化后对DPPH自由基的清除率结果见图1。
图1 两种蓝莓全果果酒模拟胃肠液消化前后对DPPH自由基清除率Fig.1 Scavenging ratios of two kinds of whole blueberry fruit wine on DPPH radical before and after simulated gastric and intestinal fluid digestion
由图1可知，两种酒体在经过胃肠液消化后对DPPH自由基的清除率都下降，样品下降的程度低于对照，且同一消化条件下样品对DPPH自由基的清除率显著高于对照（P＜0.05），这与富硒酵母的发酵有关，富硒后酵母生成β-葡萄糖苷酶能催化烷基糖苷和芳基-β-D-葡萄糖苷的糖苷键的水解转化，从而释放葡萄酒中的酚醛苷元[24-25]。样品在模拟胃肠液消化下较高的抗氧化活性也可能与富硒酵母发酵后酒体中酚酸释放氢离子后对自由基清除活性有关，也可能富硒后酵母代谢生成了硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸等含硒化合物，这些物质在模拟胃肠液消化过程对多酚类物质具有一定的保护作用。
2.2.2 ABTS自由基清除活性
ABTS自由基可与具有供氢能力的抗氧化剂反应，生成无色的ABTS，通过吸光度值的变化分析样品抗氧化能力强弱。以非富硒酵母发酵蓝莓全果果酒为对照，富硒蓝莓全果果酒样品经过不同胃肠液消化后对ABTS自由基的清除率结果见图2。由图2可知，样品和对照酒样在模拟胃肠液消化后对ABTS自由基的清除率均下降，经过胃液消化3.0 h样品和对照分别由最初的61.43%、45.34%下降为46.89%、32.17%，进一步经过肠液消化1.0 h后对ABTS自由基的清除率为33.56%和18.12%，说明部分抗氧化活性的物质包括多酚、黄酮、花青素、多糖、有机酸等在胃肠液消化后部分降解或失去活性。样品在模拟胃肠液下对ABTS自由基的清除率高于对照（P＜0.05），报道加入硒后酚酸在其芳香苯环和自由电子对之间发生共振，从而诱导电子离域，有效的电子离域增加了对ABTS自由基的清除[26-27]，因而样品在胃肠液消化后具有更高的自由基清除活性。
图2 两种蓝莓全果果酒模拟胃肠液消化前后对ABTS自由基的清除率Fig.2 Scavenging ratios of two kinds of whole blueberry fruit wine on ABTS radical before and after simulated gastric and intestinal fluid digestion
2.2.3 超氧阴离子自由基清除活性
超氧阴离子自由基是一种活性氧自由基，能使机体新陈代谢失常，引发生物体衰老，还可诱发多种疾病，如肿瘤、心血管疾病和癌症等，因而评价两种蓝莓全果果酒在模拟胃肠液消化下对超氧阴离子自由基的清除率具有重要的意义。以非富硒酵母发酵蓝莓全果果酒为对照，富硒蓝莓全果果酒样品经过不同胃肠液消化后对超氧阴离子自由基清除率结果见图3。由图3可知，样品和对照未消化时对超氧阴离子自由基的清除率分别为86.43%和78.58%，样品对超氧阴离子自由基的清除率显著高于对照（P＜0.05）。而在模拟胃肠液消化后对超氧阴离子自由基的清除能力都下降，模拟胃液消化3.0 h后下降为72.11%、65.36%，且样品的超氧阴离子自由基清除率高于对照（P＜0.05）。模拟肠液消化后清除率接近，模拟肠液消化0.5 h 后为60.44%和58.34%，1.0 h后为52.67%、49.45%。
图3 两种蓝莓全果果酒模拟胃肠液消化前后对超氧阴离子自由基的清除率Fig.3 Scavenging ratios of two kinds of whole blueberry fruit wine on superoxide anion free radical before and after simulated gastric and intestinal fluid digestion
2.2.4 羟自由基清除活性
羟自由基具有强氧化性，是一种对机体有害且毒性最强的活性氧自由基，测定羟基自由基能够综合反映物质的抗氧化活性。以非富硒酵母发酵蓝莓全果果酒为对照，富硒蓝莓全果果酒样品经过不同胃肠液消化后对羟自由基的清除率结果见图4。
图4 两种蓝莓全果果酒模拟胃肠液消化前后对羟自由基的清除率Fig.4 Scavenging ratios of two kinds of whole blueberry fruit wine on hydroxyl radical before and after simulated gastric and intestinal fluid digestion
由图4可知，样品和对照在模拟胃肠液消化下对羟基自由基有一定的清除能力，但清除率都较未消化时有一定程度的下降，样品在消化1.0 h、3.0 h后分别下降为63.45%、55.77%，而对照则下降为61.34%、55.32%，在胃液消化3.0 h后对羟自由基的清除率接近。经过肠液进一步消化1.0 h后样品和对照分别为41.89%、42.76%。结果表明，样品和对照经过胃肠液消化后对羟自由基的清除率没有明显差异（P＞0.05）。
2.2.5α-葡萄糖苷酶抑制活性
体外消化后对α-葡萄糖苷酶的抑制活性可以间接反映对机体血糖的控制，以非富硒酵母发酵蓝莓全果果酒为对照，富硒蓝莓全果果酒样品在模拟胃肠液消化后对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用结果见图5。由图5可知，两种蓝莓果酒均对α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，在模拟胃肠液消化后仍能保持较高的抑制活性。模拟胃液消化1.0 h后样品和对照对α-葡萄糖苷酶的抑制活性由45.34%、37.34%增加为46.43%、38.65%，而经过3.0 h的胃液消化后则下降为41.54%、35.67%，样品的抑制活性显著高于对照（P＜0.05）。经过肠液消化1.0 h后样品和对照分别下降为33.55%、28.57%，差异不显著（P＞0.05）。ČAKAR U等[9]报道的蓝莓果酒具有较高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，且其中的绿原酸和咖啡酸是主要的活性物质，说明果酒中的酚酸类物质是抑制α-葡萄糖苷酶活性的主要物质，而样品中的抑制活性高于对照与样品未消化前以及消化后较高的酚酸含量有关，这一结果与表2的结果相呼应。
图5 两种蓝莓全果果酒模拟胃肠液消化前后对α-葡萄糖苷酶的抑制活性Fig.5 α-glucosidase inhibitory activities of two kinds of whole blueberry fruit wine before and after simulated gastric and intestinal fluid digestion
2.3 富硒蓝莓全果果酒模拟胃肠液消化后酚酸变化
以非富硒酵母发酵蓝莓全果果酒为对照，富硒蓝莓全果果酒样品中多酚经过模拟胃肠液消化后酚酸的组成及含量进一步进行检测，结果见表2。由表2可知，样品消化前共有没食子酸、绿原酸、咖啡酸、香草醛、对香豆酸、芦丁、槲皮素7种酚酸，其中含量最高的为没食子酸（1.53 μg/mL），其次为芦丁（0.52 μg/mL），香草醛和槲皮素的含量较低，分别为0.05 μg/mL和0.09 μg/mL。各种酚酸经过胃液消化后含量都下降，胃液消化1.0 h后没食子酸含量为1.39 μg/mL，而芦丁为0.47 μg/mL，香草醛含量没变，其他几种酸略有降低，这与模拟胃液消化后抗氧化活性降低的结果相呼应。而经过模拟胃液3.0 h消化后，各种酚酸含量降低明显，没食子酸降低26.14%，而芦丁下降40.38%，其他几种酚酸都有不同程度的降低，香草醛下降为0.03 μg/mL。经过肠液的进一步消化后酚酸的含量进一步降低，香草醛在肠液消化后未检测到，咖啡酸、对香豆酸和槲皮素在肠液消化1.0 h后未检测到，没食子酸含量为0.98μg/mL，绿原酸为0.11μg/mL，芦丁为0.17 μg/mL，这一结果与相关报道的土耳其蓝莓果酒、苹果中提取多酚在模拟胃肠液消化后酚酸的含量降低的结果一致[7，22]，也与酒体模拟胃肠液后抗氧化活性、α-葡糖糖苷酶抑制活性降低的结果相呼应。
表2 样品在模拟胃肠液消化后各种酚酸的测定结果Table 2 Determination results of phenolic acids of two kinds of whole blueberry fruit wine before and after simulated gastric and intestinal fluid digestion μg/mL
富硒酵母发酵蓝莓全果果酒和非富硒酵母发酵蓝莓全果果酒在模拟胃肠液消化后总多酚含量、抗氧化活性以及对α-葡萄糖苷酶的抑制活性都较消化前下降，相同消化条件下富硒酵母发酵蓝莓全果果酒总多酚含量、抗氧化活性及对α-葡萄糖苷酶的抑制活性更高。3.0 h胃液消化1.0 h肠液消化后富硒蓝莓全果果酒中总多酚含量是对照的1.28倍，对DPPH、ABTS、O2-自由基的清除活性是对照的1.27、1.85、1.07倍，对羟自由基的清除活性与对照无显著差异（P＞0.05），对α-葡萄糖苷酶抑制活性是对照的1.18倍。富硒酵母发酵蓝莓全果果酒经胃肠液消化后主要的酚酸为没食子酸（0.98 μg/mL）、绿原酸（0.11 μg/mL）、芦丁（0.17 μg/mL）。富硒酵母发酵蓝莓全果果酒经胃肠液消化后具有较高的生物活性，适合开发功能性发酵果酒。
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