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李 蓉，林艾和，夏宗霄，龙小妹，郭 爽，范 源，2△
(1.云南中医药大学，云南 昆明 650500；
2.云南中医药大学第二附属医院，云南 昆明 650216)
女贞子为木犀科(Oleaceae)植物女贞(LigustrumLucidumAit.)的干燥成熟果实，是我国传统中药，分布于华南、华东、西南及华中各地，主产于浙江、江苏、湖南等地[1]。据文献报道，女贞子含有黄酮类、三萜类等多种化学成分及多种微量元素[2-3]；
现代药理研究表明，女贞子具有抗骨质疏松、抗肿瘤抗癌等作用，其毒副作用较低[4]。黄酮类化合物分为黄酮类、二氢黄酮类、异黄酮类、黄酮醇类、查耳酮类、花青素类、橙酮类、双黄酮类以及黄烷醇类等类型，木犀草素和芹菜素为黄酮类，广泛分布于维管束植物中；
槲皮素为黄酮醇类，主要分布于双子叶植物特别是木本植物中[5]。诸多文献研究显示，黄酮类化合物具有抗胃溃疡、神经保护、抗心肌缺血，抗炎、抗肿瘤、抗菌等多种药理作用[6]。一直以来，在药物研发领域备受关注。黄酮类化合物是女贞属中最常见的化学成分，也是女贞子中具有降脂作用最主要的成分，总有效率达91.3%，女贞总黄酮可较好的调节高血脂模型大鼠的脂代谢紊乱[7]。芹菜素属于黄酮类成分，其中卷柏、芫花中含量最高，其内在毒性低，治疗各种炎症；
且在杀死癌细胞方面显示出极好的效果[8]，木犀草素作为一种天然黄酮类化合物其抗肿瘤的发展潜力巨大[9]。槲皮素属于黄酮醇类化合物，能致突变，可以被机体吸收且经代谢后无毒性，因此具有巨大的临床应用潜力[10-12]。中药材的有效成分渗出受提取溶剂体积影响，确定提取溶剂体积有利于目标成分高效快速的被提取，且有利于稳定临床疗效。本实验通过考察4个不同料液比对女贞子中黄酮类成分的影响，为女贞子黄酮类成分的提取提供参考。
1.1 实验材料
1.1.1 仪器 DFY-600摇摆式高速万能粉碎机，永康式速锋工贸有限公司；
Agilent 1200 高效液相色谱仪，Agilent Zorbax C18 键合硅胶柱(150×4.6 mm，5 μm)，美国Agilent公司；
上海量壹科学仪器有限公司；
YL-040S语路超声波清洗机，深圳市即洁超声科技有限公司；
D2KW-D电热恒温水浴锅。AB265-S十万分之一分析天平，Mettler-Tolido International Trade(Shanghai)Co.LTD。
1.1.2 试剂 槲皮素(四川省维克奇生物科技有限公司，批号C01J10Y91727，HPLC≥98%)，木犀草素(四川省维克奇生物科技有限公司，批号C29N10Q104574，HPLC≥98%)，芹菜素(四川省维克奇生物科技有限公司，批号T30A11F112008，HPLC≥98%)，女贞子产于云南昆明；
乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 色谱条件 色谱柱：Zorbax C18(250×4.6 mm，5 μm)；
流速：1.0 mL/min；
柱温：30 ℃；
进样量：10 μL；
检测波长：365 nm；
流动相：甲醇-0.1%磷酸水，洗脱程序见表1，色谱图见图1。
表1 梯度洗脱程序
图1 女贞子中槲皮素、木犀草素和芹菜素HPLC图
1.2.2 溶液的制备
1.2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取槲皮素、芹菜素、木犀草素对照品粉末各2.63 mg，2.39 mg，2.32 mg，分别置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容配置成0.1052、0.0956、0.0928 mg/mL的对照品溶液。
1.2.2.2 供试品溶液的制备 取干燥的女贞子，粉碎，过筛，精密称取5 g女贞子粉末，置于圆底烧瓶中，分别加80%的乙醇100 mL，加热回流提取120 min，取全部过滤所得续滤液，60 ℃减压回收至膏状，加甲醇溶解移至10 mL容量瓶，定容至刻度，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，将续滤液移至高效液相进样小瓶中即得。
2.1 线性关系实验 精密量取“2.2.1”项下的各对照品溶液，等体积混合后过0.45 μm微孔滤膜，依次精密吸取2、4、6、8、10、12 μL混合对照品溶液，在“1.2.1”项色谱条件下进样；
以槲皮素、木犀草素、芹菜素的各成分质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，结果见表2，可得各成分在线性范围内均呈现良好的线性关系。
表2 线性关系考察结果
2.2 精密度实验 精密吸取同一混合对照品溶液10 μL，按照“1.2.1”项色谱条件下连续进样6次，记录所测得各化合物的峰面积，计算所得槲皮素、木犀草素、芹菜素的RSD值分别为0.17%、0.20%、0.28%，表明该仪器的精密度良好。
2.3 稳定性实验 将制备所得的供试品溶液过0.45 μm微孔滤膜，室温放置0、2、4、6、8、10 h，精密吸取10 μL，于“2.1”项色谱条件下进行测定，计算所得槲皮素、木犀草素、芹菜素峰面积RSD值分别为3.09%、1.74%、0.85%，表明该方法制备所得的供试品溶液稳定性良好。
2.4 重复性实验 制备6份供试品溶液过0.45 μm微孔滤膜，分别精密吸取供试品溶液10 μL，于“1.2.1”项色谱条件下进行测定，计算所得槲皮素、木犀草素、芹菜素峰面积RSD值分别为2.78%、2.20%、0.77%，表明该方法制备的供试品溶液重复性良好。
2.5 加样回收实验 称取6份女贞子样品，每份约5.0 g，按照“1.2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，加入槲皮素、木犀草素和芹菜素对照品适量(相当于5.0 g女贞子中所含的槲皮素、木犀草素和芹菜素的量)，再按“2.1”项下的色谱条件进样，计算平均回收率，结果见表3。
表3 加样回收率试验
诸多文献对女贞子萜类化合物研究的报道较多，而黄酮类成分也极为丰富，如槲皮素、木犀草素、芹菜素等，具有较高的药用价值[13]。黄酮类化合物一般难溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂。故本实验采用有机溶剂提取样品，分别采用甲醇、乙醇进行提取，结果表明，采用乙醇作为提取溶剂时，槲皮素、木犀草素、芹菜素的含量较高。
预实验分别以甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液作为流动相进行考察，当采用甲醇-0.1%磷酸水溶液作为流动相时，进行梯度洗脱，三个目标峰峰形较好，分离度较好，且拖尾峰峰形得到明显改善，故选用甲醇-0.1%磷酸水溶液作为流动相。同时还对柱温(25 ℃、28 ℃、30 ℃、35 ℃)进行了优化，结果显示柱温30 ℃时分离度较好。
目前大多数研究者对女贞子黄酮类成分的研究多集中在总黄酮，本实验采用高效液相色谱法，同时测定槲皮素、木犀草素、芹菜素的含量，方法简便、易行、准确度高，可为女贞子黄酮类成分的质控研究提供参考。
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