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陈 静，李 芹
溶栓治疗或经皮冠状动脉介入治疗及时恢复冠状动脉血流是减轻急性心肌缺血损伤，降低死亡率的有效策略，然而再灌注可诱发心肌缺血/再灌注(I/R)损伤。氧化应激、细胞凋亡、炎症反应是I/R发生的关键因素[1]。因此，针对上述因素制定有效的干预措施或策略对防止心肌I/R损伤具有重要的临床意义。相关研究显示，药物预处理是一种有效的心肌保护手段，可增强机体对I/R耐受能力，缩小心肌损伤面积，改善预后[2]。木棉花是木棉科木棉属植物木棉Bombax malabaricum DC.的干燥花，富含总黄酮、多糖等化学成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、降血脂、降血糖、保肝等药理活性，是中药方剂、凉茶的重要原料[3]。相关研究显示，木棉花提取物可清除内皮细胞内活性氧，抑制氧化应激，对过氧化氢诱导的内皮细胞损伤具有保护作用[4]。木棉花提取物通过调控微小RNA(miR)-30b-3p表达可抑制骨关节炎软骨细胞炎症反应和细胞凋亡[5]。然而木棉花提取物对心肌细胞I/R损伤的影响尚未明确。长链非编码RNA(lncRNA)是人类基因组中新发现的一类包含大于200个核苷酸的RNA转录本，其在细胞分化、增殖、凋亡和炎症等生理过程中发挥着重要作用，lncRNA表达改变与心肌I/R损伤相关[6]。有研究显示，心肌缺血病人血清2号染色体表达的肿瘤相关lncRNA(TALNEC2)表达上调，过表达lncRNA TALNEC2可激活Wnt/β-catenin通路，加重心肌细胞缺氧损伤，是心肌缺血的潜在治疗靶点[7]。但lncRNA TALNEC2在心肌I/R损伤中的作用尚未明确。本研究通过建立H9c2心肌细胞缺氧/复氧模型模拟心肌I/R损伤过程[8]，探讨木棉花提取物对心肌I/R损伤的保护作用，并通过lncRNA TALNEC2探讨其保护机制。
1.1 实验材料 大鼠心肌细胞H9c2购自中国典型培养物保藏中心；
木棉由医院中药房提供；
Lipofectamine 2000、Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；
细胞计数试剂盒(CCK)-8购自上海贝博生物公司；
lncRNA TALNEC2的小干扰RNA(si-lncRNA TALNEC2)及其阴性对照(si-NC)、lncRNA TALNEC2的过表达载体(pcDNA-lncRNA TALNEC2)、空载体质粒(pcDNA)购自上海生工生物公司；
丙二醛(MDA)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)活性检测试剂盒购自北京索莱宝生物公司；
膜联蛋白-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒购自上海翊圣生物科技公司；
β-actin兔多克隆抗体、Bax兔单克隆抗体(ab32503)、Cleaved-Caspase-3兔单克隆抗体(ab32042)、山羊抗兔IgG二抗(ab205781)购自美国Abcam公司；
PrimeScript逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq购自大连Takara公司。
1.2 方法
1.2.1 木棉花提取物的制备 参照文献[5]方法制备木棉花提取物：取干燥木棉花，按照料液比1∶40加入60%乙醇，微波(240 W)处理2 min，减压浓缩，40%NaOH调节pH值至9～10，静置1 h，3 500 r/min离心15 min。收集上清液，石油醚萃取2次，取水相用浓盐酸调节pH值至5～6，静置1 h，3 500 r/min离心15 min，取上清液用乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯相进行浓缩干燥即为木棉花提取物浸膏。采用NaNO2-Al(NO3)3显色法在500 nm下测定木棉花提取物含量，以芦丁为对照品制作标准曲线，经测定浸膏中木棉花总黄酮含量占45.68%。使用无血清DMEM培养基配制木棉花提取物为不同实验浓度，4 ℃保存备用。
1.2.2 细胞培养 H9c2细胞采用含有10%胎牛血清的DMEM培养基置入含5%CO2、95%空气、37 ℃恒温培养箱培养，细胞80%汇合时，按照1∶4比例传代，取第3代对数期细胞进行实验。
1.2.3 CCK-8法检测木棉花提取物对H9c2细胞的毒性作用 将H9c2细胞以每孔5×103个密度接种到96孔板，细胞贴壁后，更换为木棉花提取物终浓度为10 mg/L(低剂量组)、40 mg/L(中剂量组)、60 mg/L(高剂量组)的培养液[4]孵育细胞24 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于培养箱孵育2.5 h，酶标仪检测450 nm处吸光度(A)值。
1.2.4 模型构建、转染、实验分组 参照文献[8]方法建立心肌细胞缺氧/复氧损伤模型，将H9c2细胞接种于无血清培养基并置于缺氧密闭装置中培养6 h，缺氧培养后更换为含10%胎牛血清常规培养基于常规培养箱中培养3 h。
细胞转染：将H9c2细胞按照每孔2×105个的密度接种于6孔板，利用Lipofectamine 2000分别转染si-lncRNA TALNEC2、si-NC、pcDNA-lncRNA TALNEC2、pcDNA至50%汇合细胞，转染48 h时收集细胞进行后续实验。
实验分组：对照组为正常培养的H9c2细胞；
模型组缺氧/复氧处理的H9c2细胞；
低剂量+模型组、中剂量+模型组、高剂量+模型组在缺氧/复氧处理前，分别给予H9c2细胞木棉花提取物终浓度为10 mg/L、40 mg/L、60 mg/L的培养液处理24 h[4]，其余操作同模型组；
si-NC+模型组、si-lncRNA TALNEC2+模型组将转染si-NC、转染si-lncRNA TALNEC2的H9c2细胞进行缺氧/复氧处理。pcDNA+高剂量+模型组、pcDNA-lncRNA TALNEC2+高剂量+模型组于缺氧/复氧处理前，给予转染pcDNA、转染pcDNA-lncRNA TALNEC2的H9c2细胞木棉花提取物终浓度为60 mg/L的培养液处理24 h，其余操作同模型组。
1.2.5 酶标法检测SOD和LDH活力、MDA含量 H9c2细胞处理后，分别收集细胞和培养液上清液至干净的离心管中。采用LDH活性检测试剂盒分析培养液上清液LDH活力，向细胞沉淀中加入提取液，超声破碎细胞，收集细胞上清液，采用MDA检测试剂盒、SOD活性检测试剂盒测定细胞内MDA含量和SOD活性。
1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 将各组H9c2细胞收集在5 mL离心管中，使用预冷磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤1次，并用1×结合缓冲液调整细胞终浓度为1×106个/mL。取100 μL细胞悬液至流式管，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI室温避光孵育15 min，再加入400 μL 1×结合缓冲液轻轻混匀。1 h内采用流式细胞仪分析各组细胞样品凋亡情况。
1.2.7 蛋白免疫印记法检测Cleaved-Caspase-3和Bax蛋白表达 RIPA缓冲液提取各组H9c2细胞总蛋白，细胞蛋白经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，湿转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。在5%脱脂牛奶中封闭2 h后，将膜与Bax、Cleaved-Caspase-3、β-actin特异性一抗孵育，稀释比例为1∶1 000。4 ℃过夜孵育后，使用对应的抗兔IgG二抗室温孵育膜2 h。将PVDF膜置于保鲜膜上，加入滴加化学发光试剂，并转移膜至凝胶成像仪中曝光显影，采用Image Lab软件分析目的条带的相对灰度值。
1.2.8 实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测lncRNA TALNEC2表达 Trizol试剂提取各组培养细胞总RNA，用PrimeScript逆转录试剂盒合成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq进行RT-qPCR分析lncRNA TALNEC2表达。以β-actin为内参，2-ΔΔCt法计算lncRNA TALNEC2相对表达量。
2.1 不同浓度木棉花提取物对心肌细胞H9c2毒性的影响 与对照组比较，不同浓度木棉花提取物处理后H9c2细胞活力无变化，提示10 ～160 mg/L木棉花提取物对H9c2无毒性作用。详见表1。
表1 不同浓度木棉花提取物对心肌细胞H9c2毒性的影响(±s，n=9)
2.2 木棉花提取物对缺氧/复氧心肌细胞H9c2凋亡、氧化应激损伤的影响 与对照组比较，模型组H9c2细胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3和Bax蛋白表达量、培养液LDH活性增加(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)，MDA水平增加(P<0.05)；
与模型组比较，低剂量+模型组、中剂量+模型组、高剂量+模型组H9c2细胞凋亡率、Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白表达量、培养液LDH活性降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)。详见图1和表2。
图1 木棉花提取物对缺氧/复氧心肌细胞H9c2氧化应激损伤的影响(A为流式细胞仪检测细胞凋亡；
B为Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表达条带图)
2.3 木棉花提取物对lncRNA TALNEC2表达的影响 与对照组比较，模型组H9c2细胞lncRNA TALNEC2相对水平升高(P<0.05)；
与模型组比较，低剂量+模型组、中剂量+模型组、高剂量+模型组H9c2细胞lncRNA TALNEC2相对水平降低(P<0.05)。详见表3。
表3 木棉花提取物对lncRNA TALNEC2表达的影响(±s)
2.4 下调lncRNA TALNEC2表达对缺氧/复氧心肌细胞H9c2氧化应激损伤的影响 与si-NC+模型组比较，si-lncRNA TALNEC2+模型组H9c2细胞lncRNA TALNEC2相对水平降低(P<0.05)，细胞凋亡率、Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白表达量、培养液中LDH活性降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)。详见图2和表4。
图2 Western Blot检测Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白的表达
2.5 lncRNA TALNEC2逆转木棉花提取物对缺氧/复氧心肌细胞H9c2氧化应激损伤的影响 与pcDNA+高剂量+模型组比较，pcDNA-lncRNA TALNEC2+高剂量+模型组H9c2细胞lncRNA TALNEC2水平升高(P<0.05)，细胞凋亡率、Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白表达量、培养液LDH活性升高(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.05)。详见图3和表5。
图3 两组Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表达条带图
H9c2细胞是来源于胚胎大鼠心脏组织的亚克隆细胞株，已广泛用于建立缺氧/复氧损伤细胞模型[9-10]。本研究中低剂量、中剂量、高剂量的木棉花提取物预处理对H9c2细胞活力影响不大，表明木棉花提取物对H9c2细胞无毒性作用。心肌在I/R过程中产生大量活性氧，并攻击生物膜，导致脂质过氧化终产物MDA产生，促进LDH释放，SOD等抗氧化酶可清除活性氧，在预防脂质过氧化和心肌细胞损伤过程中发挥着重要的作用[11-12]。本研究中，缺氧/复氧处理可增加H9c2细胞MDA含量，降低SOD活性，增加细胞培养液LDH活性。本研究中木棉花提取物预处理可有效缓解缺氧/复氧诱导的氧化应激损伤，与卢秋玉等[4]报道的抗氧化损伤作用一致。心肌I/R后心肌细胞凋亡增加。本研究中木棉花提取物预处理可抑制缺氧/复氧诱导的细胞凋亡。Bax是Bcl-2家族的重要成员，受到凋亡刺激时Bax移位至线粒体导致细胞色素C释放，引发Caspase-9活化，并激活凋亡执行蛋白Caspase-3，发挥促凋亡功能[13]。本研究中木棉花提取物预处理可降低缺氧/复氧诱导的促凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3和Bax表达上调，与木棉花提取物的抗凋亡作用一致。上述研究结果表明，木棉花提取物通过抑制细胞凋亡和氧化应激，对缺氧/复氧心肌细胞损伤发挥保护作用。
lncRNA参与调控心肌细胞凋亡、自噬、坏死、氧化应激、炎症和线粒体功能障碍，在心肌I/R发生、进展中发挥着重要作用，具有治疗心肌I/R损伤的潜力[14]。lncRNA TALNEC2最初被证实参与胶质瘤、乳腺癌进展，下调lncRNA TALNEC2，阻滞癌细胞周期至G0/G1期，抑制癌细胞增殖能力[15-16]。有研究显示，脑I/R术后小鼠大脑中糖氧剥夺诱导的神经母细胞瘤细胞N2a中lncRNA TALNEC2表达上调，敲减lncRNA TALNEC2可抑制糖氧剥夺诱导的N2a细胞凋亡，并逆转I/R诱导的脑损伤和神经功能障碍[17]。淫羊藿苷通过下调lncRNA TALNEC2表达减轻缺氧诱导的成骨细胞损伤[18]。本研究中缺氧/复氧处理可增加H9c2中lncRNA TALNEC2表达水平，木棉花提取物预处理可抑制缺氧/复氧诱导的lncRNA TALNEC2表达上调，提示lncRNA TALNEC2表达可能介导木棉花提取物对H9c2细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。验证lncRNA TALNEC2功能显示，下调lncRNA TALNEC2表达可抑制缺氧/复氧诱导的细胞凋亡，增加SOD活性，降低MDA含量，并抑制LDH释放，保护H9c2细胞免受缺氧/复氧诱导的氧化应激损伤，与木棉花提取物预处理的保护作用相近。进一步研究发现，过表达lncRNA TALNEC2可削弱木棉花提取物预处理对缺氧/复氧H9c2细胞凋亡和氧化应激损伤的影响，表明木棉花提取物通过下调lncRNA TALNEC2表达，对缺氧/复氧心肌细胞氧化损伤发挥保护作用。
总之，木棉花提取物可减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞氧化应激损伤，其机制是通过下调lncRNA TALNEC2表达实现的，初步揭示了木棉花提取物的心肌保护机制，为木棉花提取物防治心肌I/R损伤提供了实验依据。
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