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章志勇，李营，姜健阁，薛万华，边奕鑫,2
(1.山东大学齐鲁医院德州医院 德州市人民医院检验科，山东德州 253000；
2.山东大学第二医院医学实验中心，济南 250033)
鲍曼不动杆菌是一种革兰阴性需氧非发酵菌，为常见的病原体之一。由于临床上抗菌药物的不合理应用和过度使用，细菌耐药率不断上升，从对单一抗菌药物耐药逐渐发展为多重耐药。多重耐药菌是指对临床使用的三类或三类以上抗菌药物同时呈现耐药的细菌[1]。常见的多重耐药菌包含多重耐药鲍曼不动杆菌(multi-drug resistanceAcinetobacterbaumannii, MDRAB)，是我国目前主要的“超级细菌”[2-3]。
分析德州市人民医院细菌耐药监测数据发现，近年来我院鲍曼不动杆菌耐药率维持较高水平，特别是碳青霉烯类抗菌药物的耐药率在70%以上，与省内其他同级医院比较，我院鲍曼不动杆菌耐药率在平均水平以上，而肠杆菌科细菌如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌碳青霉烯类耐药率维持较低水平(2%～3%)。为探究德州市人民医院鲍曼不动杆菌耐药率较高的原因，本研究收集临床科室分离培养的23株MDRAB进行流行病学调查和耐药基因及同源性分析，为临床治疗及医院感染防控提供依据。
1.1菌株来源 选取2018年1月—7月德州市人民医院住院患者临床标本中分离培养的鲍曼不动杆菌23株，去除同一患者相同标本来源的同种细菌。
1.2仪器与试剂 9120全自动血培养仪及配套血培养瓶、Phoenix-100全自动细菌鉴定及药敏分析仪和配套鉴定药敏试剂NMIC/ID-4(美国BD公司)，MALDI Biotyper全自动微生物质谱仪(德国布鲁克公司)。
1.3方法
1.3.1细菌分离培养 参照《全国临床检验操作规程》(第4版)进行菌株的分离、培养。取适量待测标本接种于哥伦比亚血琼脂平板、麦康凯琼脂平板，置于35 ℃二氧化碳培养箱中，温育18～24 h。
1.3.2细菌鉴定与抗菌药物敏感性试验 采用Phoenix-100全自动细菌鉴定及药敏分析仪对待测菌株进行鉴定及抗菌药物敏感性试验，并用MALDI Biotyper全自动微生物质谱仪对菌种的鉴定结果进行复核。依据2018年CLSI M100文件进行药敏结果判定，根据常规药物敏感试验结果，选取对β-内酰胺酶抑制剂、氨基糖苷类、头孢菌素类、氟喹诺酮类以及碳青霉烯类5类抗菌药物中的3类及以上药物产生耐药的鲍曼不动杆菌作为研究的目标菌。
1.3.3基因序列测序及数据分析
1.3.3.1基因序列测序 菌种留存传代后送华大基因(北京基因组研究所，中国深圳)进行基因检测。提取细菌基因组DNA、基因扩增后，采用Illumina HiSeq 4000系统(美国Illumina公司)对鲍曼不动杆菌的基因组进行测序；
使用Bioruptor超声波仪(美国Diagenode公司)和物理化学方法随机剪切基因组DNA以构建read文库。配对末端片段文库根据Illumina HiSeq 4000系统的协议进行测序。丢弃来自双端测序的低质量原始读数后，利用SOAPdenovo v1.05软件组装测序读数。使用针对细菌、古细菌、病毒等微生物开发的glimmer3软件，参照Hidden Markov模型对鲍曼不动杆菌基因组组装并进行基因预测。使用tRNAscan-SE、RNAmmer和Rfam数据库对tRNA、rRNA和sRNA进行识别。整体分析可以划分测序数据、组装、基因组组分分析、基因功能分析、比较基因组学分析、DNA甲基化和结题报告7个模块。
1.3.3.2同源性分析 将菌株基因组序列上传至PubMLST.org，进行多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)，应用MEGA X version 10.1生物信息分析软件依据16S rDNA序列进行系统发育分析。
1.4统计学分析 应用WHONET5.6统计软件对所有数据进行分析处理。计数资料采用例数和率进行统计描述。
2.1基本情况 在23株MDRAB中，主要来源为痰液标本(20株，87.0%)，其次分别来源于支气管肺泡灌洗液(1株，4.3%)、血液标本(1株，4.3%)、尿液标本(1株，4.3%)；
科室来源主要是ICU(8株，34.8%)，其次是呼吸内科(5株，21.7%)、神经外科(5株，21.7%)、心内科(1株，4.3%)、感染科(1株，4.3%)、神经内科(1株，4.3%)、肾内科(1株，4.3%)、泌尿外科(1株，4.3%)；
有ICU治疗史的有18例(占78.3%)，无ICU治疗史的5例(占21.7%)。
2.2抗菌药物敏感性试验结果 MDRAB对哌拉西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、头孢噻肟、头孢唑啉、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、环丙沙星、左旋氧氟沙星、莫西沙星、庆大霉素、四环素的耐药率为100%；
对米诺环素、头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星耐药率为39.1%、77.8%、87%，而对多黏菌素B耐药率为0%。
2.3全基因组测序耐药基因分布结果 根据全基因测序技术分析23株MDRAB相关耐药基因，共检出36种耐药基因，见表1。每株菌株共检出29～34种耐药基因。其中，对阿米卡星敏感的3株菌均缺失armA基因。
2.4同源性分析 根据菌株基因组序列，进行MLST，使用MLST分型(Oxford)最终确定23株菌株来自7个分型，见表2。使用MLST分型(Pasteur)，显示全部属于ST2一种分型。16S rDNA序列的系统发育树显示：23株菌和AcinetobacterbaumanniistrainATCC 19606在1个大分支上，进化距离近，而与醋酸钙不动杆菌不在一个分支，进化距离远。但在大分支的基础上，又分为2个小分支，菌株18A独立为1支，其他22株菌与Acinetobacterbaumanniistrain ATCC 19606进化距离更近，见图1。
本研究23例患者中有18例患者在诊疗过程中有ICU诊疗经历，说明患者在危重症、免疫力低下、抗菌药物大量使用状态下，易成为MDRAB感染对象。此外，鲍曼不动杆菌作为常见的环境菌，确认其是致病菌还是定植菌，对临床诊断十分重要。这需要保证每一例送检标本的质量，避免定植菌给临床治疗带来干扰和误导，造成治疗失败。
碳青霉烯类抗菌药物是临床治疗感染性疾病的最后手段，国内的耐药监测数据显示不同等级医院中耐亚胺培南鲍曼不动杆菌的检出率逐年上升[4-6]。MDRAB碳青霉烯耐药的常见机制是产生水解碳青霉烯的β-内酰胺酶，以B类金属β-内酰胺酶(MBL)和D类苯唑西林水解型β-内酰胺酶(OXA)最常见。本研究显示23株MDRAB基因组中全部含有blaOXA-23-like(blaOXA-23和blaOXA-133)、blaOXA-51-like(blaOXA-66)基因，其检出率为100%，并且多数菌株的blaOXA-23-like耐药基因的上游发现了重复序列，说明该类基因在耐药产生时起重要作用，与以往研究相一致[7-8]。VibriocholeraevarG基因编码的蛋白质是一种金属β-内酰胺酶，对碳青霉烯类药物水解活性强且不受酶抑制剂作用，本研究中此基因的检出率(21.7%)虽然相对较低，但碳青霉烯类耐药菌株对临床常用抗菌药物通常都具有较高的耐药性，需要引起关注。
表1 耐药基因检出情况
表2 菌株MLST多位点分型
图1 基于16S rDNA序列采用邻接法构建的系统发育树
氨基糖苷修饰酶的修饰作用是导致鲍曼不动杆菌对于氨基糖苷类抗菌药物耐药的主要机制。有研究报道，鲍曼不动杆菌分离株携带多个氨基糖苷类耐药基因和16S rRNA甲基化酶基因，其中ANT(3″)-Ⅰ和armA每年都能检测到[9]。本研究显示，ANT(3″)-Ⅱb、APH(3′)-Ⅰa、armA基因检出率均高于80%；
对比药敏结果，armA基因缺失的3株细菌对阿米卡星均敏感，说明16S rRNA甲基化酶在鲍曼不动杆菌的耐药机制中起到了更为主导的作用。
鲍曼不动杆菌中的MDR由多种因素促成，除了产生水解酶的耐药方式，还有复杂的外排泵系统。外排泵不仅参与MDR，而且会促进细菌的生物膜形成、毒力形成和致病等[10]。本研究中的多重耐药菌株出现了13个RND外排泵、5个MFS家族外排泵、1个ABC、1个SMR和1个MATE家族的外排泵。除tet(D)基因检出率为82.61%，tetR基因检出率为78.26%外，其余基因检出率为100%。由此可见，并非所有的外排泵都是由染色体编码。一些细菌由于通过质粒、转座子或抗性岛获得抗性基因而产生外排泵。例如，存在于鲍曼不动杆菌AYE菌株中的抗性岛AbaR1携带大约45个耐药基因，其中25个与抗菌药物耐药相关，包括外排泵基因，例如tetA、cmlA等[11]。另外，鲍曼不动杆菌通过基因水平调控各种外排泵的表达，进而实现对于多种抗菌药物及消毒剂的抵抗力，因此，抑制外排泵对抗新出现的耐药性至关重要。
目前同源性研究的方法主要是PFGE分型法、MLST以及16S RNA的DNA序列同源性分析等方法。通过测序获取待测菌完整基因组数据，包括菌株类型、种属鉴定、各种耐药基因和毒力因子的信息[12]。根据获得的基因组数据上传至相应网站进行比对分型，与PFGE分型法比较，操作简单、结果可靠。本研究通过对23株细菌进行MLST以及16S RNA的DNA序列同源性分析，显示MLST分型(Oxford)有7个型别，通过eBURST比对分析发现，其中ST540、ST191、ST1816,195、ST1806,208、ST1837,369、ST1816,1837,195,369为一个同分型组，ST381为一个单体组，而MLST分型(Pasteur)显示全部属于ST2一种分型，所以本院检出的多重耐药菌株有着非常接近的遗传特征，来自同一来源。同时参考菌株来源及患者临床信息，说明医院感染的防控工作尤为重要，而MDRAB可作为院感工作的重点监测指标。
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