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李伟亚， 祁飞燕， 孟娟， 李娜， 李晓琪, 王秋生， 唐贵良， 张战辉
(1.河南农业大学农学院，河南 郑州 450046；
2.密歇根理工大学生物系，密歇根(美国) 霍顿 49931)
microRNA(miRNA)是一类长约20～24个核苷酸的内源非编码小分子RNA，在真核生物转录后通过影响靶基因mRNA的稳定性或翻译过程来调控基因的表达[1]，其在植物的生长发育和应激反应等过程中起重要的调控作用[2-3]。拟南芥(Arabidopsisthaliana)miR161包括miR161.1和miR161.2这2个家族成员。miR161由其靶基因的反向重复序列进化而成，miR161.1与miR161.2间存在部分序列重叠[4]。miR161.1和miR161.2均可以靶向剪切PPR-P(PtypePentatricopeptiderepeatprotein)基因mRNA，参与质体RNA剪接、RNA稳定性和翻译的调控，并且一些PPR-P基因可被miR161剪切生成次级siRNA，从而调节细胞质雄性不育、逆境胁迫响应和生长发育[5-9]。目前，研究者预测的miR161靶基因包括AT1G62590、AT5G41170、AT1G64580、AT1G63630、AT1G62910、AT1G63130、AT1G62930、AT1G63080、AT1G63400、AT1G63150、AT1G63070和AT1G63330[4，9]，表明miR161可能具有多样性的功能。然而，仅有的少数相关研究主要揭示了miR161参与细胞质雄性不育的调节[10]，其他功能尚需进一步研究。
短串联靶标模拟(short tandem targets mimic，STTM)技术是研究miRNA功能的理想工具[11-12]，本研究利用已有的STTM161.1表达载体，通过花序侵染获得了miR161.1特异性敲减的突变体。研究结果可为拟南芥miR161.1的功能研究奠定基础，加深对拟南芥miR161.1分子机制的理解。
1.1 载体的构建与花序侵染转化
本研究使用的STTM161.1载体由PENG等[12]在前期研究中构建，具体构建步骤为：首先，利用集成的DNA技术设计并合成了特异性STTM引物。利用引物上的SwaI位点，通过PCR将STTM片段导入pOT2-Poly-Cis载体进行自连接，得到pOT2-STTM。其次，使用含有PacI位点的引物将pOT2-STTM载体用作起源缺失PCR的模板，产生两端具有PacI位点的STTM-CmR(氯霉素)片段。由2×35 S启动子驱动，将STTM-CmR片段与pFGC5941-PacI(用于拟南芥)克隆到双二元载体中，用限制性内切酶PacI(NEB)切割后连接。将pFGC5941-STTM质粒转化为DH5α，并在含有25 g·L-1氯霉素和50 g·L-1卡那霉素(Sigma-Aldrich)的 Luria-Bertani板上选择阳性转化[13],最终获得pFGC5941-STTM161.1的拟南芥双元表达载体(图1)。所有最终构建都通过测序验证,将构建好的载体通过拟南芥花序侵染法进行转基因，获得了转基因T0代种子。
1.2 植物生长条件
本研究所用植物材料包括拟南芥野生型Col-0、STTM161.1突变体和T-DNA插入突变体。拟南芥种子先用体积分数75%的乙醇预消毒3 min，再用体积分数10%次氯酸钠消毒10 min，最后用无菌水清洗3～5次，置于4 ℃冰箱中春化3 d促进种子萌发。3 d后将种子点播于1/2 MS培养基中(pH 5.8)，7 d后，将拟南芥从培养基中移栽到营养土(120 ℃，灭菌60 min)中。置于温室中，生长条件为(21±1)℃，光照16 h/暗8 h，相对湿度70%。
1.3 拟南芥STTM161.1转基因株系与T-DNA插入突变体的基因型鉴定
拟南芥移栽至营养土3 d后，在植株表面喷洒Basta除草剂，存活的植株初步鉴定为潜在的阳性STTM植株；
拟南芥移栽至营养土14 d左右，利用SLS法提取STTM161.1突变体、T-DNA插入突变体、野生型Col-0拟南芥植株的叶片基因组DNA，利用STTM common real primer对STTM161.1进行PCR检测和测序；
通过在线网站：http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html查找T-DNA插入突变体的检测引物(表1)，对T-DNA插入突变体进行基因型鉴定。
图1 拟南芥pFGC5941-STTM161.1的载体图谱Fig.1 Vector map of Arabidopsis pFGC5941-STTM161.1
表1 STTM与T-DNA插入突变体筛选和RT-qPCR分析所用引物Table 1 Primers for STTM and T-DNA insertion mutants screening and RT-qPCR analysis
续表Continuing table
1.4 转录组分析
为了鉴定STTM161.1突变体植株在转录组水平上的变化，对生长35 d的野生型(Col-0)植株和STTM161.1突变体植株的地上部分进行取样，使用试剂盒(TIANGEN DP501)提取总RNA。然后使用琼脂糖电泳凝胶对RNA质量进行检测，使用Nanodrop 2 000/2 000 C对RNA浓度进行检测。合格的样品提交北京贝瑞和康生物技术有限公司进行转录组测序。转录组测序和数据分析参照YANG等[14]的研究进行。
1.5 RT-qPCR定量分析
本试验对miRNA161.1及其靶基因分别进行了RT-qPCR验证。使用miRcute miRNA提取分离试剂盒(TIANGEN DP501)提取野生型(Col-0)，STTM161.1突变体的花和果荚的总RNA。使用miR 1stStand cDNA synthesis kit(by stem-loop) 逆转录试剂盒(诺唯赞)对样品的总RNA进行反转录。以U6小核RNA作为内源性对照，野生型(Col-0)作为样本对照。对STTM161.1中miRNA161.1突变体相对表达量进行鉴定。为了检测miR161.1靶基因和关键差异表达基因在STTM161.1中的表达水平。使用PrimeScript逆转录试剂盒对去除gDNA的总RNA进行反转录。使用SYBR Premix Taq II(Tli RNaseh Plus)试剂盒(中国大连Takara)，以ACTIN作为归一化的内源性对照，野生型(Col-0)作为样本对照。使用CFX96 Touch实时聚合酶链反应检测系统(Bio-Rad美国加州)仪器进行RT-qPCR反应。所使用的引物如表1所示，所有定量数据由2-ΔΔCt法[15]进行分析。利用软件SPSS22.0(IBM，NY，USA)对获得的定量数据进行方差分析和t测验。
2.1 STTM161.1突变体介导拟南芥植株中miR161.1敲减与靶基因上调表达
STTM161.1的结构包括48 nt链接序列和2个miR161.1结合位点组成，每个结合位点为miR161.1互补序列在12～14位碱基插入3个碱基(CAT)(图2-A)。根据YAN等[11]前期研究，利用Common real primer对初筛到的STTM161.1突变体植株进行PCR检测和测序分析，7株中筛选到6株为阳性(图2-B)。利用RT-qPCR对野生型Col-0与STTM161.1突变体植株中miR161.1和2个靶基因的表达水平进行分析。结果表明，与野生型相比，STTM161.1突变体中miR161.1的表达水平显著下降超过95%(图2-C)，miR161.1的2个靶基因(分别编码不同的PPR蛋白)的表达水平均显著上升超过3倍(图2-D)。结果表明，STTM技术可以有效降低目标miR161.1的表达量，并提高其对应靶基因的表达。
A， STTM161.1的结构；
B，STTM161.1突变体的PCR检测(M:MAKER;泳道1-6:STTM161.1;泳道7：野生型)；
C，拟南芥STTM161.1突变体中miR161.1的表达水平；
D， miR161.1两个靶基因的定量分析。*，**，***分别表示差异显著水平达到(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。
2.2 miR161.1敲减介导拟南芥的表型变化
对STTM161.1突变体进行表型分析。与野生型植株相比，生长21 d的STTM161.1，突变体植株表现出莲座叶较多、叶片较大、抽薹开花较早、茎基部花青素含量较多(图3-A，3-B)。生长至35 d，STTM161.1植株表现出较野生型更高的株高、更多分枝和花发育缺陷(图3-C， 3-D)。这表明miR161.1参与了拟南芥发育进程、侧生分生组织和花器官发育的调控。
进一步对STTM161.1拟南芥突变体植株的花器官形态和花粉活性进行观察与分析。与野生型(Col-0)相比，STTM161.1转基因植株花器官的形态发生了改变，包括花瓣、花药、雌蕊的大小和形状(图4-A)。进一步对花粉的活性进行检测，利用碘-碘化钾(I2-KI)染色后，在光学显微镜下使用10倍目镜观察，结果显示，STTM161.1的花粉量较野生型减少，且染色较浅(图4-B)。对STTM161.1突变体和野生型的种子发育进行分析，结果表明，STTM161.1果荚中种子较少，且部分种子败育(图4-C)。这些结果表明，miR161.1参与了花器官发育和雄性不育性的调控，并且可能参与了种子发育的调控。
A、B，生长21 d的拟南芥STTM161.1表型(Bar=5 cm)；
C，生长35 d的拟南芥STTM161.1表型(Bar=5 cm)；
D，拟南芥STTM161.1花序和果荚表型(Bar=1 000 μm)。
A，生长35 d的拟南芥STTM161.1与野生型植株花器官的形态差异(Bar=500 μm)；
B，拟南芥STTM161.1与野生型植株花粉活性分析(Bar=10 μm)；
C，拟南芥STTM161.1植株种子发育表型(Bar=1 000 μm)。
2.3 MiR161.1靶基因PPR相关拟南芥表型验证
为了进一步验证miR161.1的功能，从Arashare科技服务中心购买了2个miR161.1靶基因AT5G41170(SALK_097120C)和AT1G63080(SALK-020638C)的T-DNA突变体。通过对T2代拟南芥进行基因型鉴定，通过琼脂糖凝胶电泳检测，分别筛选到SALK_097120C35株突变体、SALK-020638C17株突变体(图5)。对突变体的表型进行鉴定，与野生型相比，突变体SALK_097120C表现出更早的抽薹开花期和较多的莲座叶，但发育后期与野生型的差异减小。通过体视显微镜观察，SALK_097120C和SALK-020638C突变体果荚种子均较少，发育不完全，出现部分败育。这些结果表明，AT5G41170和AT1G63080与miR161.1的功能有密切相关性，但相关的调控机制尚需进一步研究。
2.4 转录组分析
分别选取长势一致的拟南芥野生型(Col-0)与转基因STTM161.1植株，采集的地上部分进行转录组分析。通过对构建的6个cDNA文库进行转录组测序和分析，共筛选到225个差异表达基因，其中162个上调基因和63个下调基因(图6，表2)。其中包含线粒体特异性表达的基因(AT1G53480、AT4G08870、AT3G28510、AT5G42610，可能参与细胞质雄性不育、线粒体生成与发育、胚胎发育)、转录因子AP2/ERF(AT1G12610、AT1G63030，可能参与种子发育过程、花、果实等器官的形态建成)，转录因子MADS-M-type(AT1G28460，参与拟南芥花器官的分化)，转录因子bHLH(AT1G59640)亚家族成员BPEp通过影响花瓣发育期间的细胞扩增从而影响花瓣的大小[16]，转录因子MYB21(AT3G27810)，在花丝伸长和花粉成熟方面存在缺陷，导致雄蕊不育[17-18]，是编码基因调控花器官发育的关键基因。这些基因可能在miR161.1-PPR-P参与拟南芥生长发育、花器发育、雄性不育性、种子和果实发育调控途径中发挥着至关重要的作用。
与野生型(Col-0)相比，转基因STTM161.1在植株、叶片、果荚等表型上表现出明显差异。为了进一步确定miR161.1在拟南芥中的功能，对225个差异基因进行了GO注释 (图7)。结果表明，STTM161.1和野生型Col-0之间差异基因主要参与胁迫响应、茉莉酸响应、茉莉酸合成、萜类代谢、氧化胁迫响应等生物途径。KEGG富集分析(图8)表明，差异表达基因主要参与的代谢途径主要包括：次生代谢物生物合成、苯丙烷生物合成、嘌呤代谢、α-亚麻酸代谢等。这些结果表明，miR161.1-PPR参与了这些途径的调控，进而决定STTM161.1突变体的表型。
A，SALK_097120C与野生型莲座叶表型比较分析(Bar=5 cm)；
B、C，生长35 d SALK_097120C突变体和野生型植株表型比较分析(Bar=5 cm)；
D，SALK_097120C、SALK-020638c与野生型植株种子发育比较分析(Bar=500 μm)。
图6 拟南芥STTM161.1与Col-0的差异基因筛选Fig.6 Differentially expressed genes screened between STTM161.1 and Col-0
表2 转录组分析筛选到的主要差异表达基因Table 2 Main differentially expressed genes screened by transcriptome analysis
2.5 关键差异表达基因的RT-qPCR验证
为了验证STTM161.1突变体转录组分析结果和miR161.1参与的调控途径，选取差异基因中17个上调基因和6个下调基因进行荧光定量分析(图8)。选取的差异显著基因中的多数定量结果与转录组结果一致。在上调差异表达基因中，AT3G27810(编码MYB 21)，是调控花器官发育的关键基因，表现显著上调趋势。叶绿体、线粒体中表达的相关基因AT1G17420、AT3G45140、AT4G08870显著上调，AT1G25145基因表现下调趋势，主要参与线粒体和叶绿体外膜，参与信号或植物防御反应。这些基因的表达水平变化可能决定了花粉活性降低。AT5G47300、AT5G15660、AT3G43710(编码F-box转录因子)显著上调，激素信号途径相关的AT2G21900(编码转录因子WRKY 59)、AT5G64810(编码转录因子WRKY 51)表现显著下调，可能决定了STTM161.1突变体开花期的提前和植株性状的改变[19]。AT3G14380(编码CASPL2A2蛋白)表现显著上调，在花器官脱落中起着重要作用[20]。AT1G52040(编码MBP2蛋白)表现显著上调，CAPELLA等[21]研究表明，MBP2的转录物在雄性不育植物中高度表达。MBP mRNA在未成熟母体中的表达水平较高，并存在于多个花器官中，包括子房、胚珠、花柱、花药和雄蕊。
3.1 miR161及其靶基因的研究意义
miRNA是一类真核生物中广泛存在的约20～24个核苷酸长度的内源单链非编码RNA分子，植物miRNA通过剪切 mRNA 或抑制翻译负调控基因表达，在细胞增殖分化、个体生长发育和抵御逆境胁迫等生理过程中发挥重要作用[22-23]。miR161仅在少数几种十字花科植物中存在，包括拟南芥、甘蓝型油菜、白菜和亚麻荠(Release 22.1)[24]。在拟南芥中，miR161包括2个家族成员，miR161.1和miR161.2，可以靶向数个PPR蛋白编码基因，并介导基因的沉默[4]。此外，miR161对一些PPR蛋白编码mRNA切割可以产生次级siRNA[5]。但这些靶基因的功能仅有少数被验证，其他植物中尚无miR161及其靶基因功能的报道。本研究利用STTM技术获得了miR161.1敲减的转基因突变体，且突变体具有明显表型变异，能够为miR161功能研究奠定基础，进而应用于作物杂交种的不育化制种。
图7 拟南芥STTM161.1突变体与Col-0的差异基因GO富集分析Fig.7 Gene ontology enrichment analysis of DEGs between STTM161.1 mutant and Col-0
3.2 miR161.1参与细胞质雄性不育性的调控机制
细胞质雄性不育是由核质基因共同控制的花粉活性缺陷，细胞核恢复等位基因型可以恢复细胞质不育基因控制的雄性不育，而非恢复基因型则可维持不育系的不育性，从而可应用于作物杂交种的生产。不同植物的研究表明，恢复基因的多数属于PPR编码基因，与其他PPR蛋白不同，这些PPR在线粒体中结合雄性不育控制因子编码mRNA，从而抑制mRNA的表达[25-26]。miR161靶基因中，AT5G41170被证明编码一种PPR蛋白，该蛋白的表达可以导致拟南芥细胞质雄性不育[9]。此外，AT1G63130、AT1G62910和AT1G62930分别编码线粒体RNA剪接因子RNA PROCESSING FACTOR 3/4/6，主要参与线粒体RNA剪接的调控，进而可能决定花粉育性[27-28]。本研究，STTM161.1突变体中miR161.1显著下调表达，而其靶基因AT5G41170显著上调表达，可能是导致STTM161.1突变体雄性不育的主要原因。转录组分析筛选到的差异表达基因中，下调表达基因AT3G28510、AT5G42610可能为AT5G41170编码PPR蛋白的下游靶基因。
图8 拟南芥STTM161.1突变体与Col-0的差异基因KEGG富集分析Fig.8 KEGG enrichment analysis of DEGs between STTM161.1 mutant and Col-0
3.3 miR161.1参与的拟南芥生长发育调控途径
除调控细胞质雄性不育外，PPR蛋白通过线粒体和叶绿体RNA转录后调控途径参与植物生长、发育的调控，PPR编码基因的突变，会使植物在生长、胚胎和种子发育方面造成缺陷[9，29]。本研究中STTM161.1突变体的生育期、种子发育和花器官形态表现出明显表型转变，表明miR161.1-PPR参与了这些生长发育进程的调控。miR161.1靶基因AT1G62590被证明编码叶绿体腺苷酸环化酶，叶绿体mRNA稳定性的调控，拟南芥生长发育的调控[30]；
AT1G63130、AT1G62910和AT1G62930编码的线粒体RNA剪接因子可能也在植物生长发育过程中发挥着重要作用。另外，AT1G63080的mRNA可被miR161.2剪切产生次生siRNA，该基因的T-DNA插入突变体(SALK-020638C)表现出明显的种子发育缺陷。这表明miR161.1剪切靶基因产生次生siRNA可能也在植物生长发育中发挥重要作用。转录组测序分析结果表明，AP2/ERF(AT1G12610)，直接或间接参与种子发育、花和果实等器官的形态建成等多个进程[31-32]。转录因子AGL59(AT1G28460)与AGL48和AGL96形成复合物，参与调节种子胚胎发育、果实膨大和衰老[33]。并且在萼片、花瓣、雄蕊、心皮这4个花器官的主要基因中，大多是编码MADS-box(AGL57，AGL58，AGL64)类的转录因子，并且在产生花的细胞中具有不同的表达域[34]。另外有研究表明，它们还参与许多生物和非生物胁迫的响应[35]。转录因子bHLH其家族成员bHLH100(AT2G41240)是调节植物中微量元素铁的关键基因[36]。转录因子MYB24(AT3G27810)与MYB21双突变体花期花丝短，花药不开裂，花粉粒不能存活，是调控花器官发育的关键基因[35-37]。这些基因可能处于miR161.1-PPR调控途径的下游。
A，STTM161.1突变体与野生型Col-0转录组中上调基因验证; B，STTM161.1突变体与野生型Col-0转录组中下调 基因验证。*，**，***分别表示差异显著水平达到(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。
A, STTM161.1 and validation of up-regulated genes in the wild type transcriptome; B, STTM161.1 and validation of down-regulated genes in the wild type transcriptome. *, **, *** represent the significant difference level at P<0.05, P<0.01, and P<0.001, respectively.图9 拟南芥STTM161.1与Col-0之间关键基因DEGs的RT-qPCR分析Fig.9 RT-qPCR analysis of the key gene DEGs between Arabidopsis STTM161.1 and Col-0
3.4 结论
本研究利用STTM短串联靶标模拟技术，获得了STTM161.1转基因突变体，明确了miR161.1在拟南芥雄性不育性、生育期、种子发育等方面的功能。通过表达量以及转录组分析，鉴定到了不同材料间差异表达基因，对miR161.1参与的调控途径进行了分析。研究结果可为miR161功能解析和作物中的应用奠定基础。
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