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张闹，葛武鹏，张艳，高秦艺，何锐，张琦，原卉卉，李帅
（1.西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌712100；
2.陕西省羊乳产品质量监督检验中心，陕西 富平711700；
3.陕西百跃优利士乳业有限公司，西安710000；
4.陕西省乳品工业协会，西安710000）
母乳是婴幼儿最佳的食物来源，营养组成最符合生命早期的婴幼儿营养需求，富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、矿物质、免疫因子等多种宏量及微量营养素，对于婴幼儿的生长发育以及肠道微生态构建起着至关重要的作用[1]。母乳喂养可减少婴幼儿患病率，缓解婴儿的疼痛感、恐惧感，也可以增加婴幼儿人对新食物的接受度，是婴幼儿喂养的第一选择[1-4]，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）和国家卫生健康委员会建议婴儿喂养最优方案为前6个月纯母乳喂养[1]。而当母亲由于工作或身体等原因无法实现母乳喂养时，可选择以牛、羊乳为基料的婴幼儿配方奶粉进行喂养。牛、羊乳在营养物质组成和含量方面均与母乳存在着较大差异[5]，因此为满足婴幼儿的正常生长发育，需要对奶粉的各种营养物质进行优化使其更接近母乳。
除对婴幼儿配方奶粉的营养物质进行优化外，风味也是“母乳化”的一个重要部分。婴幼儿对于母乳有自发或先天的感知力[6]，在母乳喂养的过程中，婴幼儿可以通过气味判断母乳，进而促进他们的吸吮行为[7-9]。婴幼儿在习惯母乳喂养的婴幼儿在短时间内难以适应配方奶粉，对其接受度不高甚至不吃。因此研究母乳的风味物质构成及其量效关系，对提高婴幼儿适应配方奶粉的接受度就具有十分重要的意义。目前，对于母乳风味物质的研究相对较少，多集中在母乳贮藏或处理前后挥发性成分的变化[10-12]。张丽娜等[11]探究了冻藏条件对母乳挥发性成分的影响，发现快速及深低温恒温冷冻对母乳风味物质影响较小。
对于母乳风味的研究多使用成熟乳[7,11,13]，而母乳是一个动态变化的系统，乳的成分会随着泌乳期的不同而发生显著变化，以满足婴幼儿不同阶段的营养需要[14-15]，同时泌乳阶段是影响乳风味的一个重要因素[16]。因此本文基于顶空固相微萃取气相色谱-质谱联用技术(headspace solid phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry，HS/SPMEGC/MS）技术[17]，对不同泌乳期的母乳风味信息进行分析比较，测定其挥发性成分，旨在理清不同泌乳期母乳挥发性成分的差异，为研究更接近母乳风味、接受度更高的婴幼儿配方奶粉提供理论依据。
1.1 试验材料
不同泌乳期母乳样品：初乳(0~7 d）、过渡乳（8~30 d）、成熟乳（30 d以后），来自陕西杨凌地区20~35岁的哺乳期志愿者，所有志愿者均身体健康、母乳充足，无酗酒史，无妊娠高血压、糖尿病等影响脂质代谢疾病，且均已签署知情同意书。每种样品均由来自5~10个健康志愿者的母乳样品进行混合，混合母乳样品采用标准化的工具和流程采集，取样后分装到50 mL消毒离心管中，在冷链条件下转运至西北农林科技大学乳品加工及质量安全工程技术实验室，冻存于-80℃冰箱待检。
1.2 主要试剂
氯化钠（分析纯），广东光华科技股份有限公司；
2,4,6-三甲基吡啶（色谱纯），阿拉丁试剂有限公司；
甲醇（色谱纯），成都市科隆化学品有限公司。
1.3 仪器与设备
GCMS-QP2010Ultra气相色谱质谱联用仪，日本Shimadzu公司；
50/30μm DVB/CAR/PDMS涂层萃取头，美国Supelco公司；
DB-WAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），美国Agilent公司。
1.4 试验方法
1.4.1 挥发性成分的萃取
本文参考黄豪等[18]的方法，并加以修改。采用顶空固相微萃取的方法提取乳中的挥发性成分，并以200μg/m L的2,4,6-三甲基吡啶为内标物对挥发性成分进行半定量分析。首先分别取5 m L初乳、过渡乳、成熟乳母乳样品分别置于20 mL顶空瓶中，依次加入1.5 g氯化钠、20μL内标物，迅速拧紧瓶盖后方可上样进行后续挥发性成分的萃取和分析，所有样品均取3个平行进行试验。
HS/SPME条件：采用自动固相微萃取进样系统AOC-6000，使用已老化的萃取头对样品中的挥发性成分进行萃取，萃取深度为22 mm，萃取时间30 min，解析3 min。
1.4.2 GC/MS检测条件
GC条件：采用程序升温模式，起始温度设定为40℃，保持2 min；
以5℃/min的速度升温到90℃，保持3 min；
再以5℃/min的速度升温到130℃，保持3 min；
最后以5℃/min的速度升温到250℃，保持3 min；
进样口温度为250℃，载气为氦气，流速为1.0 mL/min，不分流进样。
MS条件：EI离子源，电子能量70 eV；
传输线温度280℃；
离子源温度230℃，四级杆，温度150℃；
质量扫描范围55~500 u；
溶剂延迟3 min。
1.5 数据处理与分析
利用气质仪器配套的软件Xcalibur进行数据采集和分析，通过检索自带的NIST谱图库进行自动匹配定性，选取匹配度大于90（最大值100）的物质，使用Excel软件对数据进行进一步半定量分析，各组分半定量分析公式为：
式中：mi表示未知物质的质量浓度，μg/L；
Ai表示未知物质的峰面积，Vi表示顶空瓶中加入未知物质的体积，mL；
A0表示内标物的峰面积，m0表示内标物的浓度，μg/L；
V0表示顶空瓶中加入内标质的体积，m L。
利用联川生物云平台（https://www.omicstudio.cn/tool）的高级热图绘制功能将半定量分析后挥发性成分的相对含量进行Z-score归一化处理后即可分析得到热图。
2.1 总离子流色谱图
采用顶空固相微萃取技术（HS/SPME)对乳中挥发性成分进行萃取，经GC/MS分离鉴定，得到初乳、过渡乳、成熟乳的总离子流图分别如图1~3所示。3种样品的出峰时间主要集中在5~52.5 min，且主要挥发性成分的出峰时间一致。
2.2 挥发性风味物质分析
通过检索NIST谱图库对图1~3进行匹配定性，选取匹配度大于90（最大值100）的物质，同时对比同一泌乳期的其他两个重复处理得出结果，经匹配分析，在3个泌乳期的乳中共检测出56种挥发性成分，其中，初乳、过渡乳、成熟乳中分别检出了39、37、41种，具体如表1所示，主要包括酯类、醇类、烷烃类、醛酮类、酸类以及醚类6大类，正是这些物质构成了母乳独特的风味。
表1 3种样品的挥发性成分成分分析
图1 初乳的GC/MS总离子流色谱图
图2 过渡乳的GC/MS总离子流色谱图
图3 成熟乳的GC/MS总离子流色谱图
（续表1）
2.2.1 酯类物质
酯类物质是酸类和醇类发生酯化作用而产生的一种物质，因其普遍具有花果香味，故而是一类良好的风味物质，也是乳制品香气成分的主要来源之一[19]。由表1可以看出酯类最为丰富，是母乳中主要的风味成分，在初乳、过渡乳、成熟乳中分别有23种、30种、27种，分别占据对应泌乳期所有乳种类的58.97%、81.08%、65.85%。其中己酸乙酯、辛酸甲酯、辛酸乙酯、癸酸甲酯、癸酸乙酯、月桂酸甲酯和月癸酸乙酯这7种物质在不同泌乳期的乳中均有较高的含量，明显高于其他酯类物质，对于母乳独特的风味贡献很大。然而由于酯类物质的风味阈值很低，所以含量较低的酯类物质对乳独特的风味也有所贡献[20]。
本研究共检测到32种酯类物质，占据总物质种类的57.14%，张丽娜等[11]在新鲜母乳中检测到5种酯类物质，总含量为4.39μg/100 mL，分析结果表明酯类物质是母乳中最主要的风味贡献者，高雅慧等[13]在6个月的成熟乳中检测到8种酯类物质，占据总物质种类的23.53%，总含量为4.25%，分析结果表明酯类物质是仅次于酸类物质的一种风味组成部分。艾对等[21]在牛、羊乳中只检测到了2~3种酯类物质，同时其含量显著低于酸类物质和烷烃类物质，张晓梅等[22]只在牦牛乳中检测到了酯类物质，而在奶牛乳和水牛乳中均没有检测到，Zhang等[23]在生牛奶中仅检测到了3种内酯类物质。由此可见，酯类物质是母乳中主要的风味物质，而对于牛、羊乳的风味贡献较小，因此为使得婴幼儿配方奶粉的风味更接近母乳，酯类物质需重点模拟。
2.2.2 醇类物质
由表1可以看出在初乳、过渡乳和成熟乳中都存在2-甲基-2-丙醇，其相对含量分别为15.42、6.48、4.44μg/L，呈现逐渐降低的趋势，艾对[21]在牛乳中发现了此物质但并未在羊乳中发现。另外，在初乳中还存在2-甲基-2-丁醇、11-甲基-1-十二醇这两种物质，相对含量分别为5.78、14.48μg/L，而在过渡乳和成熟乳中均不存在，关于母乳和牛、羊乳的风味物质研究中也未检测到这两种物质的存在，可能是由于母体的饮食、生活环境等导致了此现象的出现[7,16]。另一方面，由于醇类物质的风味阈值较高[20,24]，因此该类物质对母乳的风味贡献不大。
2.2.3 烷烃类物质
由表1可以看出，不同泌乳期阶段母乳的烷烃类物质变化较大，初乳、过渡乳和成熟乳中中分别存在10种、1种、6种烷烃类物质。本研究的初乳和成熟乳中均检测到了十二烷、苯乙烯和1,3-二叔丁基苯，相对于其他烃类物质的含量较高，张丽娜等[11]的研究也符合该结论，因此可以表明这些物质是母乳中重要的烷烃类物质。除此之外，本研究中发现仅2,4-甲基-1-庚烯在3种母乳中均存在，相对含量分别为25.96、5.37、3.47μg/L，呈现逐渐下降的趋势，但未在其他研究中发现，还有些物质只在一个阶段的乳中存在，由此猜测可能是由于母体的饮食、生活环境等导致了此现象的出现。但另一方面，由于烷烃类物质的风味阈值较高[24]，所以此类物质对于母乳风味的贡献不大。
2.2.4 醛、酮类物质
醛、酮类物质是乳脂肪氧化的产物，因其具有浓郁的奶香味、甜香味且其风味阈值较低，所以醛、酮类也是一类良好的风味物质[22,25]。由表1可以看出，初乳中不存在醛、酮类物质，过渡乳中存在正己醛和2-壬酮，成熟乳中存在正己醛、反-2-辛烯醛、壬醛、2-茨酮4类物质。
张晓梅对各类牛乳的风味物质进行对比研究发现甲基酮类物质尤其是2-庚酮、2-壬酮对于牛乳的风味贡献最大[22]，艾对也发现牛、羊乳中2-壬酮是除丙酮外主要的醛类风味物质[21]。本研究中发现，过渡乳中2-壬酮的相对含量为33.82μg/L，是醛、酮类物质中最高的，张丽娜等[11]的研究也符合该结论，因此2-壬酮也同样是母乳的主要风味贡献者之一。本研究的成熟乳样品中还检测到了2-茨酮，但其他关于母乳和动物乳风味物质的研究中均未检测到该物质，所以合理猜测可能是母体的饮食、生活环境等导致了此现象的出现[26]。
另一方面，本研究的母乳中检测到的正己醛、反-2-辛烯醛、壬醛这3种醛类物质也均在张丽娜和zhang等人的研究[7,11]中检测到，且正己醛在过渡乳和成熟乳均存在且其相对含量较高，分别为15.20、25.32μg/L，呈现良好青草味，反-2-辛烯醛和壬醛呈现良好的脂肪风味，由此可见，这3种醛类物质均是母乳中重要的风味物质。艾对等[21-22]在牛乳和羊乳中均检测到了壬醛，而正己醛和反-2-辛烯醛在牛、羊乳中均未被检测到，所以猜测反-2-辛烯醛和正己醛可能是母乳中特有的风味物质。
2.2.5 酸类物质
由表1可以看出，母乳中存在辛酸、癸酸和月桂酸3种酸类物质，张丽娜等人[7,11,13]的研究中也检测到了这些物质，由此可见这些物质是母乳中酸类物质的重要组成成分，其中月桂酸的相对含量显著低于其他两种物质。另外，张丽娜等人[7,11,13]的研究还发现了己酸等其他的酸类物质，但本研究中未检测到，可能是由于检测条件不同导致这些物质未被提取[7]。已检测到的物质中仅癸酸在3个泌乳期的乳中均存在，相对含量分别为16.64、461.36、160.34μg/L，呈现先剧增而后减少的趋势，另外，辛酸和月桂酸仅在过渡乳和成熟乳中存在，成熟乳中其含量同样低于过渡乳。
艾对等[21]在牛、羊乳中都检测到的主要酸类物质包括辛酸、月桂酸和己酸，另外在羊乳中还检测到了癸酸和壬酸，张晓梅等[22]在奶牛乳、水牛乳、牦牛乳均检测到了己酸、辛酸和癸酸，zhang等[23]在生牛乳中检测到的主要酸类物质包括辛酸、己酸、癸酸、月桂酸和壬酸。由此可见，母乳中主要呈香酸类物质种类与牛、羊乳相同，但相对含量差异较大。
2.2.6 醚类物质
由表1可以看出，仅初乳中存在对丙烯基茴香醚、乙基叔丁基醚两种醚类物质，过渡乳和成熟乳中均不存在醚类物质，其他研究中也均未检测到醚类物质。
为了更直观地观察3个泌乳期挥发性风味物质的差异，将这3个阶段的化合物分析结果归一化后绘制成热图，如图4所示。图中每一列代表不同的泌乳期的母乳样品，每一行代表母乳样品中的化合物，不同颜色的色块表示这种气味化合物的相对含量。根据热图，同一泌乳期母乳的不同样品间的挥发性风味物质含量差异不大，而不同的泌乳期样品间存在差异。初乳中的烷烃类、醇类和醚类物质的相对含量明显高于其他两个泌乳期，但由于这些物质的风味阈值较低，因而对乳的风味贡献不大；
过渡乳较其他两种乳样中的酯类和酸类成分的相对含量更高，因而过渡乳的果香味和汗味、蜡味较其他两个阶段浓[7]；
而在成熟乳中醛、酮类物质相对含量较其他两个阶段高，赋予了其浓郁的奶香、甜香味[27]。
图4 3种样品挥发性风味成分含量的热图
本研究基于HS/SPME-GC/MS技术对不同泌乳期母乳的挥发性成分种类及其相对含量进行检测，并分析其差异。研究表明3种母乳样品共检出56种挥发性成分，其中，初乳、过渡乳、成熟乳中分别为39、37、41种，主要包括酯类、醇类、烷烃类、醛酮类、酸类以及醚类等6大类，这些物质以不同的量效表达构成了母乳独特的风味，风味化学分析可知酯类成分最为丰富，是最主要的风味物质。然而，不同泌乳期乳中挥发性成分相对含量存在差异，在气味表达亦如此。过渡乳较其他两种乳样中的酯类和酸类成分的相对含量更高，因而过渡乳的果香味和汗味、蜡味较其他两个阶段更浓；
而成熟乳因醛、酮类物质相对含量高于其他两个阶段，赋予了其成熟乳浓郁的奶香、甜香味。此外，将本研究结果与牛、羊乳风味进行对比，发现酯类成分是母乳与动物乳风味存在差异的主因，因此为了使婴幼儿配方奶粉的滋气味更接近母乳，酯类物质需重点模拟。本研究可为开发更接近母乳风味、接受度更高的婴幼儿配方奶粉提供一定的参考依据。
