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陈 梅 张 昱 李冬梅 张文静,3
1 昆明理工大学医学院(昆明 650500) 2 云南省第一人民医院，昆明理工大学附属医院消化内科(昆明 650032) 3 云南省第一人民医院，昆明理工大学附属医院肿瘤内科(昆明 650032)
胃癌(gastric cancer，GC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一。幽门螺杆菌(helicobacte rpylori，Hp)感染是GC发生的独立危险因素[1- 2]，尽管根除Hp能够显著降低GC的发生率，但对于已经发生癌变的患者来说，根治Hp对胃癌的治疗并无明显帮助；
而且约一半以上的患者初次就诊时已是中晚期，失去了根治性手术切除的机会。虽然针对人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor- 2，HER- 2)的靶向疗法联合化疗对HER2阳性的胃癌患者带来了一定的临床获益[3- 5]；
相比于单独化疗，程序性细胞死亡-1/程序性细胞死亡配体1(programmed cell death protein 1/ programmed cell death protein ligand 1, PD-1/PD-L1)抑制剂联合化疗也提高了高度微卫星不稳定(microsatellite-high，MSI-H)的晚期胃癌患者的客观缓解率[6- 7]，但仅有极少数患者存在HER2阳性或MSI-H，而且治疗后均存在耐药现象。基于上述原因，目前晚期胃癌患者的总生存期(overall survival，OS)仍不尽如人意。因此，寻找新的预后和治疗靶点，能够为制定临床决策提供一定的理论帮助。
NOTCH信号通路参与胃癌的多个生物学过程，包括细胞增殖、凋亡、侵袭和转移以及血管形成。Mastermind-like 1(MAML1)是一种转录共激活因子，能够与所有哺乳动物均有的四个NOTCH受体锚蛋白重复结构域结合，与ICN和RBP-Jkappa形成DNA结合复合物，并放大NOTCH诱导的HES1转录，从而充当NOTCH信号的转录共激活因子[8- 9]。然而，MAML1在胃癌中的表达、生物学功能及潜在分子机制目前罕有报道。本研究应用生物信息学方法分析MAML1在胃癌中的表达及与胃癌患者临床特征及预后的相关性，并预测了MAML1的潜在关联基因、信号通路及肿瘤浸润淋巴细胞。为进一步体外研究MAML1在胃癌中的生物学功能及分子机制提供了一定的理论基础。
1.1 MAML1在胃癌组织和正常组织中的表达
癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)数据库是大型癌症基因组计划的免费数据门户[10]。我们从TCGA数据库获取了具有RNA-Seq表达和相匹配临床病理信息的胃癌患者数据。通过The Human Protein Atlas数据库中MAML1在胃癌和正常胃组织中的免疫组化结果观察其表达和分布情况。
1.2 MAML1在GSE15459数据集中的表达水平与预后的关系
从GEO数据库下载数据集GSE15459，该数据集芯片信息如下：GLP570(Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array)，包含200例原发性胃癌的基因表达信息[11]。根据MAML1的中位表达水平，将胃癌患者分为MAML1高表达组(MAML1-high)和MAML1低表达组(MAML1-low)，使用Kaplan-Meier进行对其总生存期(overall survival, OS)进行分析，以探索MAML1表达水平与胃癌患者生存期之间的关系。
1.3 蛋白质相互作用分析
使用在线工具STRING探索与MAML1可能存在相互作用的蛋白[12]，设置Pearson相关系数>0.5，预测的蛋白数量为50。
1.4 MAML1相关基因的功能注释
利用Funrich在线工具分析MAML1相关基因所富集的功能和通路[13]。
1.5 TIMER 数据库分析
肿瘤免疫浸润评估资源(tumor immune estimation resource，TIMER)涵盖 32 种癌症类型并包含来自 TCGA 数据库的10 897个样本[14-15]。通过TIMER数据库评估胃癌患者中 MAML1的表达水平与六种浸润免疫细胞(CD8+T 细胞、CD4+T 细胞、B 细胞、树突状细胞巨噬细胞和中性粒细胞)丰度的相关性，并评估MAML1表达水平与肿瘤纯度之间的关系，联合GEPIA数据库分析MAML1表达与肿瘤浸润免疫细胞之间的关系。P<0.05认为差异有统计学意义。
2.1 MAML1在胃癌中的表达水平
首先，TCGA数据库在线分析结果提示：MAML1的表达水平在胆管癌(cholangiocarcinoma，CHOL)、食管癌(esophageal carcinoma，ESCA)、多形成性胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)、头颈鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSC)、肾乳头状细胞癌(kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP)、急性髓细胞样白血病(acute myeloid leukemia，LAML)、低级别脑胶质瘤(brain lower grade glioma，LGG)、胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma，PAAD)、肉瘤(sarcoma，SARC)、胃癌(stomach adenocarcinoma，STAD)、胸腺癌(thymoma，THYM)等多种恶性肿瘤显著高于相匹配的正常组织(图1A，P<0.05)。在The Human Protein Atlas数据库中免疫组化染色提示(图1B)：MAML1在胃癌组织中呈高表达，且以细胞核分布为主。与上述结果类似，MAML1 mRNA在胃癌组织中的表达水平同样高于正常胃组织(图1C，P<0.001)。
2.2 MAML1高表达的患者预后较低表达患者差
随后，下载GSE15459数据并进生存曲线分析，结果提示：与MAML1-low组胃癌患者相比，MAML1-high患者的生存期更短(图2A，P=0.01)。在亚组分析中，临床III期的胃癌患者在MAML1-low和MAML-high人群间显示出总体生存率的显著差异(P=0.02，图2D)，而在I、II和IV期患者中未见显著性差异(P>0.05，图2B、C、E)。在有淋巴结转移的患者中，MAML1-low组的OS明显优于MAML-high组(图2G)，而无淋巴结转移的患者未见显著性差异(图2F)。相反，在无远处转移的患者中，MAML1-low组的患者OS优于MAML1-high组(图2H)，但有远处转移的患者中未见显著性差异(图2I)。另外，无论患者是进行手术切除还是进行了术后以5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)为基础的化疗，均存在MAML1-low组的患者生存显著优于MAML-high组患者(图2J、K)。以上结果提示，MAML1高表达的胃癌患者提示较短的生存期，且MAML1表达水平可能与III期胃癌患者的OS及淋巴结转移存在正相关，而与患者是否接受手术治疗或化疗无明显关系。
图2 MAML1表达水平在胃癌患者的预后分析注：MAML1表达水平与(A)总体人群、(B)临床I期、(C)II期、(D)III期、(E)IV期患者、(F)无淋巴结转移N0、(G)有淋巴结转移(N1+2+3)、(H)无远处转移(M0)、(I)有远处转移(M1)、(J)仅接受手术治疗、(K)接受时候辅助化疗的患者OS的相关性。
2.3 MAML1相关作用蛋白的预测及功能和信号通路富集分析
为探讨MAML1的高表达导致胃癌患者预后差的分子机制，我们应用STRING数据库分析了相关系数位居前50的MAML1作用蛋白(图3A)。其中，位居前十位的分别是：NOTCH1、RBPJ、EP300、NOTCH2、HEY1、NOTCH4、HES5、MAML2、MYC和HEY2。其相关系数均大于0.94，而且大多数是NOTCH信号通路成员。
随后，FUNRICH软件对上述50个预测基因进行生物学功能和信号通路的富集分析显示：90.2%的MAML1相关基因分布在细胞核中，34.1%位于核仁(图3B)；
分子功能方面，22.4%的基因参与转录因子活性，16.3%的基因参与转录调节活性(图3C)；
在信号通路富集方面，38.5%的基因参与雄激素受体途径(P<0.001)、30.8%参与C-MYB转录因子调控途径(P<0.05)、23.1%参与HIF- 2-alpha 转录因子网络等途径(图3D)；
生物功能过程方面，44.9%的基因参与核碱基、核苷、核苷酸和核酸代谢的调节(图3E)。上述发现表明，与MAML1相关的基因大多位于细胞核中，发挥转录调控功能，可能扮演激活剂或共激活剂的转录协同因子的作用。
图3 胃癌组织中MAML1的潜在作用蛋白及其富集分析注：(A)按相关系数排名的前50个MAML1潜在关联蛋白的网络构建；
50个关联蛋白在(B)细胞分布、(C)分子生物学功能、(D)生物学信号通路和(E)生物学功能方面的富集分析。
2.4 MAML1表达水平与肿瘤浸润免疫细胞表达的相关性分析
研究表明，肿瘤浸润淋巴细胞的高低与免疫检查点抑制剂的疗效有一定的相关性。因此，我们进一步分析了MAML1表达水平与六种浸润性免疫细胞(CD8+T 细胞、CD4+T 细胞、B 细胞、树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)和肿瘤纯度的相关性。结果显示(图4)：MAML1与B细胞(r=0.133，P=0.001)、CD4+T细胞(r=0.298，P<0.001)、巨噬细胞(r=0.119,P=0.002)的表达水平存在显著的正相关关系，但与肿瘤纯度、CD8+T细胞、中性粒细胞、树突状细胞无显著相关性(P>0.05)。
图4 MAML1与胃癌纯度、不同浸润免疫细胞(B细胞、CD8+T细胞、CD4+ T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞)间的相关性分析
随后，我们应用GEPIA分析了MAML表达水平与B细胞、巨噬细胞及各种功能性T细胞基因标记之间的关系。其中，GEPIA数据库中功能性T细胞包括 Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、Tfh、T细胞耗竭和Treg细胞。见表1：在胃癌中，MAML1表达水平与大多数免疫细胞标记物相关。MAML1表达水平与PD-1、TIM3、CTLA4等T细胞耗竭的细胞标志物显著相关；
还与STAT3、STAT6、STAT5A显著相关。以上发现提示：MAML1的表达水平可能与肿瘤免疫逃逸、PD-1/PD-L1/CTLA1抑制剂治疗的疗效有关。
表1 MAML1与GEPIA 中免疫细胞基因标记之间的相关性
靶向治疗和免疫检查点抑制剂治疗为HER2阳性和MSI-H的晚期胃癌患者的治疗带来了新的曙光。然而，HER2阳性或MSI-H的胃癌患者不足10%，绝大部分患者并无明确的治疗靶点；
而且胃癌的发生和转移涉及复杂多变的分子网络及调控机制。因此，寻找新的分子标记物并探讨其与肿瘤微环境的关系显得尤其重要。本研究探索了NOTCH信号通路中的一个关键分子——MAML1在胃癌中的表达水平和其相关蛋白及肿瘤免疫浸润细胞的关系，不仅拓展了NOTCH信号通路的研究内容，而且为MAML1有可能成为胃癌预后指标、潜在治疗靶点及免疫治疗疗效指标提供了理论基础。
据报道，MAML1在食管鳞癌中异位过表达，且与食管癌患者的不良预后、肿瘤浸润深度、肿瘤分化程度和肿瘤分期显著相关[16-17]。敲低MAML1能够下调CD44+肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)的迁移能力，并降低细胞对5-FU的耐药性[18]，表明MAML1有可能成为靶向CSCs的食管癌治疗靶点。该研究中，生物信息学分析发现MAML1在胃癌组织中呈异常高表达，并且与较差的总体生存率密切相关。既往研究表明，NOTCH信号通路参与多种恶性肿瘤干细胞的自我更新、细胞增殖和分化[19- 20]，并介导了化疗和靶向药物的耐药性[21- 22]。而MAML1作为NOTCH信号通路中的重要组成部分，介导了该途径下游基因的激活和肿瘤的发生发展。此外，MAML1还是β-连环蛋白(β-catenin)，核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)和p53途径的激活因子[23- 25]。Wnt/β-catenin、NF-κB和p53信号通路参与多种恶性肿瘤的发生发展、肿瘤耐药及干细胞特性，其上述功能的发挥主要是通过在细胞核内积聚，从而影响下游癌基因或抑癌基因的转录水平。该研究通过富集分析发现，MAML1相关蛋白主要分布在细胞核，并主要参与转录功能，与上述报道的机制及功能方向基本一致。由此可见，MAML1能够介导多种信号通路和多种生物反应之间的相互影响，有可能在胃癌的发生、转移和耐药过程中发挥一定的生物学作用。
STRING分析发现细胞周期蛋白依赖性激酶8(cyclin-dependent kinase 8，CDK8)是MAML1的相互作用蛋白之一；
同时，CDK8是急性粒细胞白血病的治疗靶标[26]。SEL120- 34A是一种新型的CDK8抑制剂，能够通过抑制STAT1 S727和STAT5 S726反式激活的磷酸化，从而抑制细胞增殖并影响干细胞特性[27]。该研究中，GEPIA分析发现MAML1表达水平与STAT3、STAT6、STAT5A显著相关，或许也可能参与了SEL120- 34A的药理作用，但需要进一步的体外和体内实验验证。有研究表明，在人黑色素瘤细胞系M537中，敲低MAML1的表达能够增加transwell小室中的NK和CD8+T细胞数量，从而影响肿瘤细胞的迁移能力[28]。该研究发现，MAML1的表达水平与B细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞的浸润水平具有显著一致的相关性。对免疫细胞标志物的进一步分析表明，MAML1与PD-1、TIM3、CTLA4等T细胞耗竭的标志物之间亦存在显著相关性。以上发现提示：MAML1可能参与调节肿瘤微环境，从而影响PD-1/PD-L1/CTLA4抑制剂的疗效，因此有可能将来成为免疫治疗的疗效预测指标之一。
总之，我们首次揭示了MAML1在GC患者中异常高表达，可能是预后不良的预测因素。MAML1的作用蛋白参与多种分子生物学过程和信号通路，还可能在分子转录层面和调节肿瘤免疫微环境方面发挥了重要作用。深入研究MAML1及相关蛋白在胃癌中的功能及分子调控机制将有利于进一步了解胃癌的发病和耐药机制，为寻找新的胃癌预后和治疗靶标提供了理论依据。
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