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刘 阳 郭 鹏 张 楠 王福金 王靖宇 王爱国
(1.大连医科大学实验动物中心，大连 116044)(2.北京大学人民医院胃肠外科，北京 100034)
皮肤伤口愈合始终是医学界关注的焦点。伤口愈合包括急性炎症、细胞增生、组织重建等多个动态的生理学过程，其中任何一个过程的失调都可引起伤口恶化，致使伤口愈合延迟，加重患者的痛苦。21世纪以来，冷等离子体医学的快速发展为皮肤伤口的愈合提供了优良的治疗方案。目前，等离子体因其广泛的灭菌能力，可减少伤口细菌载量，防止伤口感染；
其活性物质可促进凝血、激活免疫细胞、调节免疫反应、抑制炎症、促进血管增生、改善组织微循环、促进细胞增殖和组织修复；
同时还具有刺激小、痛苦轻、见效快、使用方便等优点，已广泛应用于临床的伤口治疗。本文在等离子体的基础简介后，将从伤口愈合的凝血期、炎症期、迁移/增殖期以及重塑期的进程，综述冷等离子体促进伤口愈合的分子机制研究进展。
1.1 等离子体的概念
等离子体是广泛存在于宇宙中的除固、液、气之外的物质第四态，是气体的电离形式。产生等离子体所需的能量可由热、化学、电和辐射能单独提供，也可组合提供[1]。当气体获得一定能量后，气体分子被电离，形成相互作用和自由运动的电子和正离子的混合物，这种物质状态因其负离子和正离子的总量相等，所以被称为等离子体。
1.2 等离子体的分类
等离子体根据粒子温度，通常可分为高温等离子体(T>108K～109K)与低温等离子体(<103K)【K：开尔文(热力学单位)】。高温等离子体中的气体几乎处于完全电离的热平衡状态，各种粒子的平均动能相同，因此也称为完全热力学平衡等离子体，一般指核聚变等离子体，包括太阳日冕，磁约束聚变或惯性约束聚变。低温等离子体按重粒子温度水平又分为热等离子体(重离子温度：3×103K～3×104K)和冷等离子体(重离子温度：300 K左右)。其中热等离子体局部处于热力学平衡，也称局部热力学平衡等离子体，由于热等离子体的高能量密度，目前主要将其用于材料合成、球化、致密以及保护性涂层的沉积。而在冷等离子体中，重粒子温度相对较低，电子温度远大于重粒子温度，体系处于非平衡状态，所以又称非热力学平衡等离子体，其主要应用于等离子体刻蚀、沉积以及等离子体表面修饰。生活中被广泛应用的等离子体均属于人工等离子体，其常通过燃烧与放电产生，原子弹、氢弹爆炸时及受控热核聚变所产生的等离子体便是通过燃烧产生，而电弧等离子体，高频等离子体等则是通过放电产生。工业应用中一般分为真空(低压)放电方式和大气(常压)放电方式。考虑到处理速度与成本，冷等离子体的产生通常避开真空放电而选择大气压放电，所以冷等离子体也叫大气压冷等离子体(cold atmospheric plasma，CAP)。
由于高温等离子体与热等离子体中不仅含有大量的活性物质，还伴有大量的热能，高达几千至上万摄氏度，因此限制了其在生物医学领域的应用。而冷等离子体(CAP)接近或略高于室温，不会对生物组织造成热伤害，为其医学临床应用提供了先决的条件[2-3]。
2.1 冷等离子体的产生
为获得有效的冷等离子体，研究人员研发了3种电极放电方式，相应地把产生的冷等离子体分为直接、间接与杂合三类[4]。
直接冷等离子体的典型代表是浮动电极——介质阻挡放电(floating electrode dielectric barrier discharge, FE-DBD)，高压(供电)电极通过绝缘介质直接与机体(接地电极)相互作用，在其间放电产生冷等离子体(图1)[5-6]。由于绝缘介质的阻挡，可有效抑制两电极间气体间隙内电流的无限增长，从而避免产生火花放电。依照电流体动力学原理，产生的带电粒子(等离子体)在电场作用下作定向移动，形成诱导气流，流向并作用于组织表面。直接冷等离子体可产生均匀和高浓度的等离子体活性物质，相较其他放电设备而言，冷等离子体成分也较易控制。其主要缺点是必须保持电极与组织之间的有效距离(1～5 mm)，因此作用区域范围小、距离近，应用不便[7]。
图1 直接等离子体(DBD)原理(A)与实物(B)[7]
间接冷等离子体是先在两电极之间产生冷等离子体，然后通过气流形成等离子体射流作用于机体(图2)[2,6]。间接冷等离子体有效增加了作用距离和安全性，应用广泛、灵活[3]，且可通过调节气源的种类改变等离子体的活性物质组分，从而获得应用于有特定要求的等离子体[8]。其缺点是需要附加气源供应设备，作用面积小，不便携带[5]。
图2 间接等离子体(kINPen)原理(A)[9]与实物(B)[7]
杂合冷等离子体的典型代表是表面微放电等离子体(surface micro discharge, SMD)，其依照直接等离子体发生装置的原理，将电极设计为三层结构，供电平面电极通过绝缘介质平板将高电压信号施加到网状电极形成高压电场，从而在网状电极一侧产生冷等离子体(图3)。并借鉴间接等离子体的方法，通过封闭的气体循环装置将产生的等离子体输送到待处理的组织[9]。杂合冷等离子体大大增加了SMD电极与靶标组织之间的距离，而且不需要附加气源供应设备[5]。其缺点是需要在封闭的空间内实施[9]。
图3 杂合等离子体(FlatPlaSter)原理(A)与实物(B)[6]
2.2 冷等离子体的应用方法
目前，冷等离子体的应用方法主要分为间接与直接两种。间接应用是指将冷等离子体作用于培养液，再用处理过的培养液处理细胞，如应用等离子体活化培养液(plasma activated medium, PAM)具有显著的抗癌作用[10]，关于将CAP间接应用于伤口治疗的研究目前还未见相关报道。直接应用是将冷等离子体直接作用于靶组织和细胞，目前已获得CE认证用于临床伤口治疗的产品化等离子体仪有kINPen®MED(德国)、PlasmaDerm®VU-2010(德国)与SteriPlas(英国)。kINPen®MED已用于治疗持久的慢性和感染伤口，特别是在常规治疗失败的情况下，冷等离子体治疗使超过80%的患者重新开始或加速了伤口愈合过程，直至完全闭合伤口[8]；
在一项随机和对照的临床实验中，PlasmaDerm在治疗慢性腿部溃疡方面是安全且有效的[11]；
此外，有研究经证实可有效减少伤口的细菌负担促进其愈合并减轻局部疼痛[12]。
2.3 冷等离子体的生物活性成分
目前，等离子体在医学领域已经展现出广阔的应用价值。首先，在食物与医疗器械的灭菌消毒方面，研究发现等离子体对于革兰阴性菌、革兰阳性菌、细菌孢子、细菌生物膜及真菌等都具有灭活能力，CAP还被证明能有效地灭活空气和水中的人类诺如病毒和MS2病毒[13]。相比于暴露于高温或化学品的常规灭菌方法更温和更广谱，具有良好的灭菌消毒作用。另外，因冷等离子体不会对人体和周围正常细胞产生伤害，安全性高，被广泛应用于伤口愈合、口腔卫生保健领域、美容美肤、血液凝固、肿瘤治疗、基因转染等方面[14-19]。特别是在伤口治疗方面，相比于其他传统的治疗手段，等离子体不仅显著的促进了伤口的愈合，而且作用温和、痛苦少，尚未发现明显的副作用或并发症。目前，应用冷等离子体处理创伤已经是临床医学领域较为成熟的治疗技术手段，具有良好的应用前景，也是研究的热点。
大量研究表明，CAP可以有效促进伤口愈合，其分子机制涉及促进再上皮化、释放细胞因子和生长因子、血管生成、成纤维细胞活化，以及杀菌和抑制炎性反应等[14](图4)。但目前关于CAP的分子机制研究主要来源于体外实验，其深入的分子机制仍亟待阐明。伤口的愈合过程大致可分为凝血期、炎症期、迁移/增殖期、以及重塑期，但伤口实际的愈合过程是连续且相互重叠的复杂过程，但为了方便叙述，本文将上述的4个经典分期为基础，综述CAP促进伤口愈合的分子机制研究进展(表1)。
表1 等离子体促进伤口愈合的机制研究进展
注：图中概括了体内外CAP介导的分子与细胞作用：促进再上皮化和加速伤口愈合；
通过激活身体保护机制(BD和Nrf2信号传导)和将免疫细胞募集到伤口区域来减少炎症；
激活成纤维细胞，诱导肌动蛋白细胞骨架的重新排列并促进基质合成(COL1A1，COL14A1)；
激活成纤维细胞和角质形成细胞中与伤口愈合相关的细胞因子和生长因子；
诱导新生血管的形成。
4.1 凝血期
凝血期是止血和保护伤口的首要阶段，其主要过程为形成血栓，封闭伤口，同时为细胞迁移和血小板聚集提供骨架结构[20]。血栓的形成主要是在凝血因子Ⅲ的作用下把凝血酶原转变为凝血酶，凝血酶再通过水解纤维蛋白原使其转变为不溶的纤维蛋白，促进纤维蛋白/血小板凝块形成，从而达到止血的作用[21]。2006年，有研究通过DBD装置进行体外凝血实验，发现CAP可加快血栓的形成[22]。2017年，有研究通过体外和体内实验进一步证明了CAP的有效促凝血作用[23]。在CAP的促凝血机制研究方面，有研究建立的CAP促使血液中纤维蛋白原凝聚的学说得到了广泛的认可[24]。但CAP的其他可能促凝血机制尚有待进一步探究。
4.2 炎症期
炎症期在受伤后即可启动，在急性伤口可持续数小时至数天，在慢性伤口可持续数周甚至数月。此过程主要是炎性细胞迁移至伤口处进行杀菌和清创，为随后的增殖期创造良好的条件[25-26]。中性粒细胞和巨噬细胞是最主要的炎症期功能细胞。中性粒细胞的主要功能是清除细菌，预防感染。由单核细胞转化来的巨噬细胞，特别是M1型巨噬细胞发挥着吞噬坏死组织、崩解的中性粒细胞碎片和细菌产物的重要清创功能。
在杀菌方面，中性粒细胞外网状陷阱(neutrophil extracellular traps，NETs)结构能限制感染部位的病原体的扩散，并在形成过程中释放多种杀菌物质，创造高浓度的杀菌环境来捕获与杀灭病原微生物，是中性粒细胞杀菌的重要机制[27]。CAP可诱导中性粒细胞NETs的产生，增强其杀菌效能[28]。CAP还可诱导中性粒细胞分泌IL-8[28]，而趋化因子IL-8可进一步促使中性粒细胞向伤口部位的迁移。另外，CAP还可以诱导β-防御素的表达[29]。β-防御素是由真核细胞产生的富含二硫键的阳离子型抗菌多肽，具有直接杀菌功能。再者，成纤维细胞与角质形成细胞经CAP处理后，它们分泌的与创伤愈合相关的细胞因子及生长因子(如IL-6、IL-8、MCP-1、TGF-β、CXCL-1与CD154)表达增高，更有力地招募与激活了炎性细胞，这可能是CAP促进炎症阶段免疫防御的重要因素之一[26]。
在清创方面，有研究发现CAP可刺激单核细胞分化为巨噬细胞，并进一步促进促炎型(M1型)巨噬细胞的分化，促进清创进程[29]。另外，CAP还可促进M1型巨噬细胞产生大量肿瘤坏死因子(TNF-α)、IL-6等促炎细胞因子[30]，进而激活T细胞和浆细胞，促进伤口愈合和抗感染能力[21]。
在炎性反应过程中，创面组织中有白细胞和巨噬细胞等炎性细胞浸润，一旦被激活，它们将产生大量的活性氧，可以起到杀菌，信号传导，调节炎性反应等作用，这是机体自我防御的重要机制。但过度产生的活性氧反而导致了组织损伤和炎性反应加重，致使创面难以愈合[31]。研究发现，CAP可通过激活机体的抗氧化应激保护机制，拮抗过度的氧化应激，降低炎症损伤，进而加速伤口愈合[14]。Keap1-Nrf2-ARE是组织细胞抗氧化应激的关键信号通路，其最终通过调节抗氧化蛋白和II相解毒酶的表达，保护细胞免受炎性反应导致的氧化应激的损伤。有研究发现CAP可诱导Keap1与细胞质中的肌动蛋白细丝共定位，进而释放并促进Nrf2的核移位，调节抗氧化应激酶的表达，促进伤口愈合[32]。有研究使用CAP处理人THP-1单核细胞，发现血红素加氧酶1(Hmox1)表达显著增加[33]。用CAP处理角质形成细胞，Nrf2通路得到了显著的激活[14]。这些结果说明，调节抗氧化应激是CAP促进伤口愈合的重要分子机制之一。
4.3 迁移/增殖期
此期又称为肉芽期或增生期，始于皮肤创伤后48 h内，持续2～3周，以不同类型的细胞增殖和迁移为特征。这个阶段主要是完成再上皮化与形成肉芽组织，分别由成纤维细胞、血管内皮细胞和角质形成细胞主导完成[20]。
再上皮化包括上皮细胞的增殖、迁移与分化。表皮受损后，损伤处周围断端的基底细胞不断分裂增殖，并向创面迁移，新生的上皮细胞继续分裂增生，逐渐分化，最终恢复表皮屏障功能。CAP可以促进角质细胞的迁移与增殖继而促进伤口的愈合。有研究[34]利用CAP处理HaCaT细胞，观察到HaCaT的运动性显著增加，还发现了HaCaT细胞中Cx43 mRNA和蛋白的表达显著降低，其中Cx43是角质形成细胞的缝隙连接蛋白，它的高表达会抑制细胞迁移与伤口愈合的能力。同时，经CAP处理后HaCaT增殖率也显著增加[34]。
真皮和皮下组织的损伤依靠肉芽组织修复。肉芽组织是一种幼稚结缔组织，它的形成主要包括成纤维细胞与内皮细胞的增殖，以及细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的合成和新血管的形成，其中胶原纤维是ECM的主要成分[35]。肉芽组织不断填充创腔，取代了凝血期形成的纤维蛋白临时基质[35]。有研究观察到利用CAP在短时间内处理MRC5成纤维细胞后，成纤维细胞运动性显著增加[34]。另外，有研究应用CAP处理BALB/c小鼠的皮肤伤口或体外培养的L929鼠成纤维细胞，发现CAP可通过诱导ROS的产生，下调IκBα的表达，进而激活NF-κB信号通路，达到促进成纤维细胞增殖的目的[36]。为了监测CAP治疗后不同细胞的相互作用，有研究优化了一种将角质形成细胞和成纤维细胞结合在一起的体外共培养模型，通过划痕实验，发现CAP显著增加了共培养中的相对伤口密度，但对单一相对伤口密度没有显著影响[37]。此外，有研究证明了CAP能促进内皮细胞的迁移、增殖以及血管生成。他们发现CAP显著诱导内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活化与磷酸化，从而增加内皮细胞内源性NO的水平，进一步激活促血管生成VEGFA/VEGFR2信号通路[38]。在此阶段TGF-β也对细胞迁移和增殖、细胞外基质合成以及血管生成有积极的作用。有研究表明CAP可以激活成纤维细胞与角质形成细胞中TGF-β1与TGF-β2的表达[29,39]。
迁移/增殖阶段的后期，从伤口边缘迁移/增殖的成纤维细胞在巨噬细胞分泌的TGF-β的作用下，部分细胞分化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞是一种收缩细胞，它通过整合素附着在聚合的纤维连接蛋白和胶原纤维上，并通过富含肌动蛋白的细胞骨架将胶原纤维垂直拉向伤口边缘，从而使得创面收缩[40]。成纤维细胞与肌成纤维细胞相互作用，产生了ECM。研究表明，CAP不仅可激活成纤维细胞，而且参与成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化[14]。
4.4 重塑期
重塑期又称为重构期，在炎症期ECM形成后，始于ECM中Ⅲ型胶原被I型胶原取代时，可持续一年或更长时间[20]。重塑期的核心过程是通过细胞外基质的重组、降解和再合成来形成最大的抗拉强度，以I型胶原为主的瘢痕组织，保护伤口[35,40]。在此阶段，活化的成纤维细胞(表达α-SMA的肌成纤维细胞)发挥着核心作用。研究表明，CAP可诱导成纤维细胞活化，增加I型胶原纤维的合成。有研究通过体外实验发现，CAP处理的成纤维细胞显著提升了I型胶原纤维的合成和α-SMA mRNA的表达[14,39]。在体内实验中，CAP同样显著促进了真皮I型胶原纤维合成，以及COL14A1和α-SMA的表达[14,39]。此外，在Arndt等应用CAP处理成纤维细胞时，还发现丝氨酸蛋白酶抑制蛋白E1(PAI-1)的含量显著增加[39]。而PAI-1在伤口愈合的重塑期中发挥着抑制蛋白酶、协调组织重塑过程的重要作用。
等离子体医学作为一个结合等离子体物理学、生命科学和临床医学的新兴研究领域，越来越多的研究者参与其中，推动了等离子体医学的快速发展。展望未来，等离子体医学的研究应着重解决以下三方面问题：(1)等离子体作用分子机制的研究，如：等离子体中起作用的活性物质是哪些？等离子的作用是如何从皮肤向深层组织传导的？等离子体起作用的生物学介质是哪些？其生物学介质是如何激发机体的体液和细胞反应的？(2)等离子体发生装置的改进，如：廉价、高效等离子体气源的探索；
如何增加等离子体活性物质浓度；
如何增加等离子体射流的作用面积和作用距离；
适用于临床应用等离子装置的参数、标准、最佳工作环境条件等方面；
(3)拓展等离子体在其他疾病治疗中的临床应用，如：肿瘤、炎性反应相关的各种疾病等。
