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张珊滋，王春燕，丁文欢，贺 元，李安林，郭 瑛，田 莉.2*
(1.新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011；
2.新疆名医名方与特色方剂学实验室，新疆 乌鲁木齐 830011)
全球恶性肿瘤的发病率和死亡率不断升高，严重威胁着人类健康。癌症的病因复杂，现有化疗药物易产生耐药性并伴有严重不良反应，导致癌症易转移、易复发。研究表明，在西药治疗时介入中药可明显增强疗效，减轻毒副作用，逆转药物耐药[1-2]。同时，中药具备多成分、多靶点、多通路的作用特点，在防治癌症方面呈现协同作用优势，尤其药食同源的中药成为抗肿瘤新药研发的热点[3]。
疏花蔷薇(RosalaxaRetz.)为蔷薇科(Rosaceae)灌木，广泛分布于新疆海拔500～1 200 m的平原荒漠、戈壁荒地、干沟或河谷旁，抗逆性强，资源丰富[4]。疏花蔷薇果为疏花蔷薇的干燥果实，属药食同源，富含黄酮、三萜酸、维生素C、多糖、氨基酸等多种化学成分[5-6]。疏花蔷薇果收载于WS3-BW-0103-98《中华人民共和国卫生部标准》(维吾尔药分册)和《哈萨克药志》，具有固精止泻、消肿疗疮、益肾明目、通经止痛等功效[7]。研究发现，疏花蔷薇果具有抑菌[8]、抗氧化[9]、调节脂质代谢[10]等作用。目前，尚未见关于疏花蔷薇果抗肿瘤作用研究的报道，基于此，作者采用CCK-8法研究新疆疏花蔷薇果30%乙醇部位(E1)、50%乙醇部位(E2)、70%乙醇部位(E3)、90%乙醇部位(E4)、水部位(E5)对人胃癌细胞MGC-803、人食管癌细胞Eca-109、人肺癌细胞NCI-H1299及A549、小鼠腹水瘤细胞S180、人慢性髓原白血病细胞K562、人组织细胞淋巴瘤细胞U937和人乳腺癌细胞MCF-7体外增殖的抑制作用，为疏花蔷薇果开发为天然抗肿瘤药物提供依据。
1.1 材料、试剂与仪器
疏花蔷薇果，购自新疆和田地区，经新疆医科大学徐海燕教授鉴定为疏花蔷薇(RosalaxaRetz.)的干燥果实。人胃癌细胞MGC-803、人食管癌细胞Eca-109、人肺癌细胞NCI-H1299及A549、小鼠腹水瘤细胞S180、人慢性髓原白血病细胞K562、人组织细胞淋巴瘤细胞U937、人乳腺癌细胞MCF-7，由中科院细胞库提供。
0.25%胰蛋白酶(批号25200-056)、胎牛血清(FBS，批号42H9852K)，美国Gibco公司；
磷酸盐缓冲液(PBS，批号0120S22-584-01)，北京希诺因子科技有限公司；
RPMI 1640完全培养基(批号AG29637393)、DMEM高糖培养基(批号AG29714104)、青霉素-链霉素溶液(批号SV30010)，美国HyClone公司；
细胞增殖及毒性检测试剂盒(批号BB01171010)，北京博奥森生物技术有限公司；
二甲基亚砜(DMSO)，北京索莱博科技有限公司；
5-氟尿嘧啶(纯度98%，批号N20N11W131790)，上海源叶生物科技有限公司；
AB-8树脂，沧州宝恩吸附材料有限公司；
无水乙醇；
实验用水为蒸馏水。
Galaxy 170R型二氧化碳培养箱，德国Eppendorf公司；
洁净工作台、Multiskan GO型全波长酶标仪，美国Thermo公司；
SSW-420-2S型电热恒温水槽，上海博迅实业有限公司；
Motic AE31型倒置显微镜；
3-18K型离心机，德国Sigma公司；
AB135-S型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 不同极性部位的提取
称取干燥疏花蔷薇果5.0 kg，粉碎过10目筛，即得疏花蔷薇果粗粉；
按料液比1∶18(g∶mL,下同)用65%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并提取液，减压浓缩后干燥，即得粗浸膏；
取粗浸膏适量，加蒸馏水配制成每毫升含1 g原药材的溶液，并按原药材与树脂质量比1∶2上样，依次用30%、50%、70%、90%乙醇洗脱，分别收集洗脱液，浓缩后冷冻干燥，分别得到30%乙醇部位(E1)、50%乙醇部位(E2)、70%乙醇部位(E3)和90%乙醇部位(E4)。粗提后药渣按料液比1∶10用蒸馏水煎煮提取2次，每次1 h，合并提取液，浓缩后冷冻干燥，得到水部位(E5)。
1.2.2 供试品的制备
分别精密称取上述疏花蔷薇果不同极性部位100 mg，用DMSO配制成质量浓度为200 mg·mL-1的溶液，给药前采用相应的培养基配制成质量浓度为2 000 μg·mL-1的母液，经0.22 μm滤膜过滤除菌，分装，-20 ℃储存备用，临用前现配。
1.2.3 细胞培养
细胞复苏后分别接种于装有培养基的培养瓶中，其中MGC-803、Eca-109、NCI-H1299、A549、S180、K562和U937细胞接种于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640完全培养基，MCF-7细胞接种于DMEM高糖培养基，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。隔天换液，及时传代，取对数生长期的细胞进行后续实验。
1.2.4 不同极性部位体外抗肿瘤活性的测定
分别取对数生长期的MGC-803、Eca-109、NCI-H1299、A549、S180、K562、U937、MCF-7细胞，用PBS清洗2次后，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化2～3 min，然后加入1～2 mL RPMI 1640完全培养基终止消化，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，再加入1 mL RPMI 1640完全培养基吹打均匀，制成单细胞悬液后计数，调整细胞终浓度为8×103～10×103个·mL-1，接种至96孔板中，每孔接种100 μL细胞悬液，置于细胞培养箱中培养24 h后弃去培养基，加入100 μL不同浓度的含药培养基，实验组加入终浓度(μg·mL-1)分别为1 000、300、100、30、10、3 的疏花蔷薇果不同极性部位溶液；
阳性对照组加入终浓度(μg·mL-1)分别为100、30、10、3、1、0.3的5-氟尿嘧啶(5-Fu)溶液；
空白对照组仅加入相同体积的培养基。每组设置3个复孔，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养72 h，弃上清液，避光加入100 μL 10%CCK-8溶液，在细胞培养箱中继续孵育1 h，采用酶标仪测定450 nm处吸光度(OD)。按式(1)计算样品对细胞增殖的抑制率，并运用SPSS软件计算半数抑制浓度(IC50)，以IC50值作为评价疏花蔷薇果不同极性部位对不同肿瘤细胞的毒性指标。
(1)
1.3 数据处理和分析
2.1 疏花蔷薇果不同极性部位对肿瘤细胞形态的影响
在倒置显微镜下观察，与空白对照组相比，给予不同浓度的疏花蔷薇果不同极性部位后，低浓度条件下出现肿瘤细胞增殖速度变慢，细胞变圆、涨大的现象；
高浓度条件下出现细胞皱缩破裂，细胞间隙明显增大，细胞碎片增多，细胞呈沙粒状空泡的现象，在1 000 μg·mL-1、300 μg·mL-1、100 μg·mL-1浓度条件下，大部分肿瘤细胞均无法维持完整的细胞形态。
2.2 疏花蔷薇果不同极性部位对肿瘤细胞增殖的抑制作用
疏花蔷薇果不同极性部位对肿瘤细胞增殖的抑制率见表1，对肿瘤细胞的IC50值见表2。
表1 疏花蔷薇果不同极性部位对肿瘤细胞增殖的抑制率Tab.1 Inhibition rate of tumor cells by different polar extracts of Rosa laxa
续表1
表2 疏花蔷薇果不同极性部位对肿瘤细胞的IC50值Tab.2 IC50 values of different polar extracts of Rosa laxa Retz.fruits to tumor
由表1、表2可知，与空白对照组相比，给予疏花蔷薇果不同极性部位E1、E2、E3、E4、E5作用72 h后，各肿瘤细胞的增殖均受到不同程度的抑制，并呈浓度依赖性。其中，E1对各肿瘤细胞增殖的抑制作用最明显，IC50值为(19.63±0.36)～(206.60±3.38) μg·mL-1；
E1、E2对MGC-803细胞的增殖均有明显抑制作用，IC50值分别为(19.63±0.36) μg·mL-1、(47.24±0.49) μg·mL-1；
E3对S180、U937细胞具有一定的抑制作用，IC50值分别为(73.18±8.31) μg·mL-1、(69.06±1.14) μg·mL-1；
E4对Eca-109、NCI-H1299、S180细胞的增殖有较弱的抑制作用，IC50值分别为(58.06±3.63) μg·mL-1、(79.31±5.93) μg·mL-1、(75.71±5.77) μg·mL-1；
E5可明显抑制K562、S180细胞的增殖，IC50值分别为(30.04±2.68) μg·mL-1、(42.38±5.97) μg·mL-1。
2.3 讨论
蔷薇属植物富含的多糖、类胡萝卜素、类黄酮和酚酸等活性成分与抗肿瘤活性具有潜在联系。肖辉等[11]研究发现，野蔷薇果的乙醇提取物可诱导人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(Bcap-37)、人卵巢癌细胞(HO8910)和人膀胱癌细胞(T24)的早期凋亡，并可抑制小鼠S180实体瘤的生长，延长腹水瘤小鼠的生存时间。黄俞龙等[12-13]研究发现，从金樱子提取物中分离获得的黄酮类成分槲皮素、芦丁及多糖类成分，能有效抑制人肝癌细胞(BEL-7402)的增殖，且对正常肝细胞(HL-7702)的毒性较低。Fujii等[14]研究发现，犬蔷薇的甲醇提取物中含有的原花青素可以防止豚鼠皮肤和小鼠黑色素瘤细胞中黑色素的生成。Ayati等[15]研究发现，犬蔷薇提取物可抑制人结肠癌细胞(Caco-2、HT-29)、MCF-7细胞、HeLa细胞和人肝癌细胞(HepG2)的生长，并且在正常肝细胞原代培养中无毒性。
疏花蔷薇果中主要含有黄酮、多酚、多糖等化学成分，已有研究表明，植物中含有的黄酮、多酚成分具有一定的抗肿瘤作用，能抑制胃癌细胞增殖[16]，多糖类成分能促进K562细胞凋亡[17]、抑制动物S180实体瘤的生长[18]。本研究采用CCK-8法初步考察了疏花蔷薇果不同极性部位的体外抗肿瘤活性，发现不同极性部位对8种肿瘤细胞的增殖均有不同程度的抑制作用，抑制率与提取物浓度呈明显的量效关系。其中，E1对各肿瘤细胞增殖的抑制作用强于其它极性部位，对MGC-803细胞的抑制作用尤为显著，IC50值为(19.63±0.36) μg·mL-1，表明疏花蔷薇果30%乙醇部位富集了较多抗肿瘤活性成分；
E5对K562细胞增殖的抑制作用显著，IC50值为(30.04±2.68) μg·mL-1，对S180细胞也具有较好的抑制作用，IC50值为(42.38±5.97) μg·mL-1，可能与水部位中含有多糖等极性较大的化学成分有关；
除E2对S180细胞增殖的抑制作用较弱外，其余极性部位对该细胞均有一定的抑制作用，这与其同属植物野蔷薇果的抗肿瘤活性部位相一致。
采用CCK-8法研究了新疆疏花蔷薇果30%乙醇部位(E1)、50%乙醇部位(E2)、70%乙醇部位(E3)、90%乙醇部位(E4)、水部位(E5)对人胃癌细胞MGC-803、人食管癌细胞Eca-109、人肺癌细胞NCI-H1299及A549、小鼠腹水瘤细胞S180、人慢性髓原白血病细胞K562、人组织细胞淋巴瘤细胞U937和人乳腺癌细胞MCF-7体外增殖的抑制作用。结果表明，与空白对照组相比，疏花蔷薇果不同极性部位对各肿瘤细胞的体外增殖均具有不同程度的抑制作用，其中E1对各肿瘤细胞增殖的抑制作用最明显，对MGC-803细胞的抑制作用尤为显著，IC50值为(19.63±0.36) μg·mL-1；
E3对U937细胞的增殖有一定抑制作用，IC50值为(69.06±1.14) μg·mL-1；
E4对Eca-109细胞的增殖有一定抑制作用，IC50值为(58.06±3.63) μg·mL-1；
E5对K562细胞的增殖有明显的抑制作用，IC50值为(30.04±2.68) μg·mL-1。疏花蔷薇果具有开发为天然抗肿瘤药物的潜在价值，疏花蔷薇果发挥抗肿瘤作用药效成分的分离、纯化及其作用机制有待后续进一步研究。
