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杨秀芹，张 倩，李佳欣，郝婉君，张晓涵，何鑫淼，庞 宇
（1.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030；
2.黑龙江省农业科学院畜牧研究所，哈尔滨 150086）
嵌合RNAs（chimeric RNAs）是指由两个或两个以上独立基因融合产生的新RNAs。这种嵌合RNA常常与肿瘤发生、发展密切相关。目前，已发现大量肿瘤特有嵌合RNA，其中一些嵌合RNA 可作为肿瘤诊断和预后标记物[1]。随着高通量测序技术发展，越来越多研究表明，正常生理条件下也存在嵌合RNA，其广泛参与各项生命活动，在调控基因表达、细胞活力和生长等方面发挥重要作用[2-3]。
相邻基因间顺式剪接（cis-splicing of adjacent genes，cis-SAGe）是在转录和转录后水平上产生嵌合RNA 的主要方式之一。cis-SAGe 是同一条染色体上两个相邻基因间发生转录通读，再通过内含子剪接将不同基因外显子连接成一个嵌合RNA 过程[4]。内含子剪接是真核生物基因表达调控重要手段，cis-SAGe 和经典内含子剪接机制相同，均由剪接位点（Splice sites，SS）、小分子核糖核蛋白等共同参与完成。剪接时，在剪接增强子、沉默子等剪接调控元件（Splicing regulatorycis-elements，SRE）调控下，pre-mRNA 上 SSs 与小分子核糖核蛋白共同装配成RNA 剪接复合体，形成套索结构，切除内含子，将外显子连接[5]。根据SRE 相对位置和作用，可分为外显子剪接增强子（Exonic splicing enhancer，ESE）、内含子剪接增强子（Intronic splicing enhancer，ISE）、外显子剪接沉默子（Exonic splicing silencer，ESS）及内含子剪接沉默子（Intronic splicing silencer，ISS）。这些顺式作用元件通过招募剪接因子影响剪接位点选择，调控剪接过程。目前有关cis-SAGe 剪接调控机制研究较少，亲本基因外显子被剪接的决定因素尚不清楚。
B-细胞淋巴瘤因子2 样蛋白2（B-cell lymphoma 2-like 2 protein，BCL2L2）是细胞凋亡重要调控因子，抑制线粒体介导的凋亡途径，增强细胞运动性、促进神经元存活和分化[6-7]。核多聚腺苷酸结合蛋白1（poly（A）binding protein nuclear 1，PABPN1）是一种普遍存在的多聚腺苷酸化因子，对真核细胞多聚（A）尾延伸至关重要[8-9]。
本实验室前期在猪脂肪组织中鉴定一个cis-SAGe产物——BCL2L2-PABPN1（BP）[10]。为进一步分析嵌合子BP 剪接调控机制，试验利用minigene、半定量RT-PCR技术、结合生物信息学分析鉴定影响嵌合子生成的SRE；
同时比较分析BP 和亲本基因组织表达和亚细胞定位情况，研究结果进一步揭示BP转录后调控机制，为探究BP功能提供基础。
1.1 引物设计与合成
根据本实验室克隆的BP cDNA 序列（GenBank No.MH795109）及其Blat（http://genome.ucsc.edu/cgibin/hgBlat）分析结果，设计引物M1F/R 和M2F/R，分别用于扩增猪 BCL2L2 外显子 3～4 和 PABPN1 外显子 1～2 基因组 DNA 片段，在 M1R 和 M2F 引物 5"末端引入限制性内切酶EcoRⅠ识别位点。同时设计引物用于对BCL2L2 内含子3 的5"端、3"端及PABPN1 外显子4 的5"端序列进行缺失突变。此外，设计引物MAR 与T7F 引物配合使用，对minigene转录产物进行半定量RT-PCR 鉴定。本研究中所有引物均使用Primer premier 5.0 软件自行设计，由北京华大基因科技有限公司合成。引物序列见表1。
表1 引物信息Table 1 Primer information
1.2 核酸提取
民猪耳组织样采自黑龙江省农业科学院畜牧研究所，利用常规酚-氯仿法提取基因组DNA。利用 TRIzol（Invitrogen，CA，USA）提取细胞总RNA，严格按照说明书操作。利用琼脂糖凝胶电泳检测核酸质量及完整性，利用Nanodrop 2000（IMPLEN，CA，USA）测量核酸浓度。
1.3 半定量RT-PCR
利用 Vazyme 公司（Nanjing，China）HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR 试剂盒进行反转录（Reverse transcription，RT）反应，合成cDNA，严格按照试剂盒说明书操作。PCR 反应总体系为10 μL，含有2×TaqMaster Mix 5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各 0.4 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 3.7 μL。目的基因和内参退火温度分别为56 和60 ℃，循环数均为24个。
1.4 minigene构建
以基因组DNA 为模板，分别利用引物M1F/R和M2F/R 进行PCR 扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，通过EcoRⅠ（TaKaRa）酶切位点连接，克隆入pMD18-T 载体（TaKaRa）中，测序验证。构建的克隆载体和pcDNA3.1+分别用KpnⅠ和XbaⅠ（TaKaRa）双酶切后，利用T4DNA连接酶（Ta-KaRa）连接，转化大肠杆菌DH5α，阳性菌落经菌液PCR 初筛后，提取质粒进行双酶切鉴定后测序验证。在此步骤中，PCR 反应利用2×TaqMaster Mix进行催化，酶切和连接反应均严格按照产品说明书操作。
1.5 缺失突变
利用重叠延伸PCR方法对minigene上片段进行缺失突变[11]。该方法由两轮PCR反应组成，第一轮反应（反应a 和b）通过引物设计在两个小片段末端引入缺失，再通过PCR 反应（反应c）将两个片段拼接，将缺失引入到扩增产物内部。各缺失片段引物见表1，缺失突变反应方案见表2。在反应a和b 利用高保真DNA 聚合酶催化，反应总体系为25 μL，含有 2×Phanta Max Master Mix（Vazyme）12.5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，野生型 minigene 质粒 DNA 25 ng。反应 c 利用 2×TaqMaster Mix 进行催化，以便在扩增产物末端引入A，方便后续T-A 克隆，模板为反应a 和b 扩增产物稀释物。
表2 重叠延伸PCR中引物配对使用方案Table 2 Pairing scheme of primers in overlapped-extension PCR
1.6 细胞培养与转染
猪肾上皮细胞PK-15 按照常规方法培养，在细胞汇合度达到90%时，利用Lipofectamine 2000TM试剂（Invitrogen，CA，USA）进行转染，严格按照试剂说明书操作。24 h后收集细胞。
1.7 剪接元件鉴定
RT-PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用Image J 软件进行灰度值分析，分析缺失突变对minigene转录产物量的影响。利用在线工具regRNA2.0（http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/）鉴定潜在的剪接元件。
1.8 实时荧光定量PCR
利用实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR）方法分析BP、BCL2L2 和 PABPN1 在不同发育时期脂肪组织中表达情况，模板cDNA合成方法见1.3，qPCR 反应利用Vazyme 公司AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix进行，严格按照该试剂盒说明书操作。以β-actin 作为内参，利用2-ΔΔCt方法计算目标基因相对表达量。
1.9 亚细胞定位
将BP、BCL2L2 和PABPN1 基因全长编码区分别克隆入pEGFP-N1载体，构建真核表达质粒。其中BP 插入到HindⅢ和KpnⅠ限制性内切酶识别位点间，BCL2L2 和PABPN1 利用EcoRⅠ和KpnⅠ限制性内切酶进行克隆。上述质粒转染PK-15 细胞，24 h 后收集细胞，利用DAPI 染色，在荧光显微镜（Zeiss Axiovert 200 M）下观察重组荧光蛋白在细胞内分布情况，拍照。
1.10 统计分析
利用SPSS 19.0进行统计分析，通过t检验分析野生型对照组和片段缺失组差异显著性。各试验均独立重复3 次。
2.1 minigene构建及转录产物验证
BP 两个亲本基因——BCL2L2 和 PABPN1 分别含有4 个和7 个外显子，串联排列于猪7 号染色体上，中间间隔小于10 kb。BP通过cis-SAGe典型方式剪接形成：除BCL2L2 最后一个外显子和PABPN1第一个外显子外，两个亲本基因其他外显子均完整保留于BP[10]。为鉴定BP 剪接的影响因子，本研究选取BCL2L2外显子3和PABPN1外显子2之间部分基因组序列，构建猪嵌合RNA BP 的minigene（见图1）。根据理论推测，minigene BP应有两种顺式剪接产物：嵌合RNA（产物A）以及正常、包含所有外显子产物（产物B）。minigene 转染PK-15细胞后，经RT-PCR检测发现，两种预期产物均存在（见图2），测序分析证明RT-PCR 扩增结正确性。说明minigene可转录产生两种成熟mRNA，用于后续剪接调控分析。
图1 minigene结构及预期产物Fig.1 Schematic structure and the theoretical products of minigene
图2 minigene转录产物鉴定Fig.2 Identification of the splicing products of minigene
2.2 内含子3的3"末端剪接调控元件鉴定
首先对内含子3的3"端进行片段缺失分析，并结合生物信息学方法鉴定重要剪接调控元件。共构建3 个缺失突变型minigene，瞬时转染、RTPCR 分析发现，片段A 缺失导致嵌合分子表达量极显著下降（P＜0.01），片段C 缺失导致嵌合分子表达量显著下降（P＜0.05），片段B 缺失不影响嵌合分子表达（P＞0.05），如图3所示。生物信息学分析发现，缺失片段A 和C 上均存在thyroid hormone receptor exon 9 和 gh-1 intron 3 等 反 应 元 件 ，详见表3。
表3 生物信息学预测的剪接增强子Table 3 Splicing enhancer predicted by bioinformatic method
图3 内含子3的3"端缺失对嵌合子生成的影响Fig.3 Effects of deletion in 3"end of intron 3 on the production of chimeric RNA
2.3 内含子3的5"端剪接调控元件鉴定
在内含子3 的5"末端，片段1 缺失导致嵌合分子表达量极显著下降（P＜0.01），片段2缺失导致嵌合分子表达量显著下降（P＜0.05），片段3缺失不影响嵌合分子表达（P＞0.05），如图4所示。在缺失的片段1 和2 上均预测到多个内含子剪接增强子元件，且二者不存在共同元件，详见表3。
图4 内含子3的5"端缺失对嵌合子生成的影响Fig.4 Effects of deletion in 5"end of intron 3 on the production of chimeric RNA
2.4 外显子4剪接调控元件鉴定
在BCL2L2外显子4上研究发现，片段A或B缺失均导致嵌合分子表达量极显著下降（P＜0.01），片段C缺失导致嵌合分子表达量显著下降（P＜0.05）。生物信息学分析发现，这三个缺失片段只存在一种外显子剪接增强子——srp40-exonic splicing enhancer，详见表3。
2.5 组织表达分析
RT-PCR 分析发现BP 普遍表达于所检测的各种组织中（见图6A）。qPCR分析表明，在不同发育时期脂肪组织中，BP 表达模式和两个亲本略有不同（见图6B），随日龄增加，BP 表达量逐渐上升，在180日龄时达到最高，之后略有下降。
图6 BP组织表达（A）及在脂肪组织中发育性表达（B）分析Fig.6 Expression of BP in tissues(A)and in developmental fat tissues(B)
2.6 亚细胞定位分析
BP和亲本的亚细胞定位结果如图7所示。
由图7 可知，BCL2L2 在细胞核与细胞质中均有表达，BP 和PABPN1 则主要在细胞核中表达。亚细胞定位是基因功能基础，由此推测BP 在功能上可能更接近于PABPN1。
图7 BP和亲本亚细胞定位结果Fig.7 Subcellular localization of BP and the parent genes
图5 外显子4片段缺失对嵌合子生成的影响Fig.5 Effects of deletion in exon 4 on the production of chimeric RNA
cis-SAGe包括两个连续反应：转录通读和剪接加工。目前在转录通读调控机制方面研究较多，已发现转录因子CTCF、poly（A）信号等因素影响转录通读[12-13]。与亲本基因序列组成的比对分析发现，cis-SAGe在转录后剪接加工过程中，去掉两个亲本间临近外显子，典型方式为5"亲本的最后一个外显子和3"亲本的第一个外显子作为内含子被剪接掉[14-16]，剪接机制与经典剪接一致，这些外显子发生跳跃（Exon skipping）的原因尚不清楚。
Minigene是研究基因表达调控的有力工具，用于分析突变对基因表达的影响、鉴定可变剪接转录本和顺式调控元件、揭示不同细胞内剪接差异及机制[17-18]。Minigene 正确表达关键是含有SSs，SSs 位于内含子上，包括5"末端的GU、3"末端的AG 和位于 3"SSs 上游 18～40 nt 的分支点。SSs 突变常常导致错误剪接，在成熟mRNA中出现序列缺失或增加[19]。对于一些较大内含子，可截取其3"和5"末端部分序列参与构建minigene，降低minigene 长度，提高转染效率。本研究中参与剪接形成嵌合子的两个内含子均较小，故将所有碱基全部用于构建minigene，完整保留SSs；
且在构建各缺失突变体时，均保留内含子3"末端的60 bp 和5"末端的10 bp，确保剪接信号不受片段缺失影响，保证minigene 转录后剪接顺利进行。与理论预期一致，minigene转录产生外显子跳跃和包含所有外显子的两种剪接产物。本研究重点是鉴定影响嵌合子形成的顺式作用元件，所以仅对发生外显子跳跃的mRNA（即嵌合RNA）表达情况进行研究，鉴定有潜在作用的反应元件。
ISE 有助于小外显子进行高效剪接[20]；
ESE 位于外显子上，但影响剪接位点正确选择、使用[21]。在BP 剪接生成过程中，BCL2L2 内含子3 和PABPN1内含子1及二者之间序列被作为一个大的内含子剪接掉，这个大内含子的5"和3"末端提供SSs，同时原有剪接信号被忽视。为确定引起这些变化的因素，本研究分析BCL2L2 内含子3 和外显子4上剪接调控元件，鉴定BP 表达影响因子，发现srp40-exonic splicing enhancer、thyroid hormone receptor exon 9、gh-1 intron 3、β-tropomyosin exon 6b等元件可能在嵌合子表达剪接调控中发挥作用。Srp40 蛋白结合位点调控基因转录后剪接过程，直接影响剪接能否正常进行[22]，ASB10基因上该位点突变导致原有剪接位点不被识别，生成新的成熟mRNA[23]，在外显子4 的3 个缺失片段上均仅预测到srp40-exonic splicing enhancer 反应元件，其对嵌合子生成的影响，值得进一步研究。gh-1 intron 3最早发现于人生长激素-1（Growth hormone-1，GH-1）基因内含子3 上，核心序列为G2X1-4G3，该序列突变导致GH-1 基因剪接时发生外显子3 跳跃，生成截短蛋白质多肽链，影响正常蛋白质分泌[24]。人GH-1 研究表明，gh-1 intron 3 不存在累加效应，与其他ISE 序列不同[24]。多数ISE 均是以多拷贝形式存在并调控可变剪接转录本表达时具有累加效应，如鸡β-tropomyosin 内含子 7、人α-globin 内含子2上鉴定到的ISE序列[25-26]。本研究在缺失片段A和C 中均检测到gh-1 intron 3，其作用方式及是否具有累加作用，还需进一步深入研究。
本试验利用半定量RT-PCR、生物信息学分析及定点突变技术鉴定影响嵌合RNA BP剪接生成的调控元件，发现srp40-exonic splicing enhancer、thyroid hormone receptor exon 9、gh-1 intron 3、βtropomyosin exon 6b等元件具有重要作用，且BP在组织中普遍表达且受发育调控，通过亚细胞定位分析确定BP 与亲本PABPN1 均定位在细胞核内，推测二者可能在功能上更接近，为深入分析BP 转录后调控机制提供参考。
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