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李 蕊，秦秋实，张 玥，曹 颖，闫 杰，朱鏐娈
尽管大量研究阐明了肝纤维化形成的细胞和分子机制，但仍迫切需要有效的治疗方法和治疗靶点[1，2]。前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)是在各种组织中存在最广泛的前列腺素[3]。E型前列腺素受体4(E series of prostaglandin receptor 4，EP4)是4种E型前列腺素(E-type prostanoid，EP)受体之一，即EP1、EP2、EP3和EP4。PGE2与EP4结合，介导调控机体多种生物学功能。EP4受体是目前发现PGE2受体中最具功能和潜力的受体[4]。EP4在肾脏、心脏、肺、肠道、血管和皮肤等多部位组织都有表达，起着重要的病理生理作用[5]。多种慢性炎症和自身免疫性疾病与EP4受体相关[3]，在肿瘤生长、转移以及关节炎等疾病发生过程中起致病作用[4]。EP4受体拮抗剂(E7046)是一种高选择性小分子的EP4抑制剂，抑制单核细胞和髓系细胞向肿瘤相关巨噬细胞和髓系抑制细胞分化[6]，逆转PGE2的免疫抑制作用，最终增强宿主的抗肿瘤免疫应答[7]。我们前期在非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型研究发现，小鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)表面EP4受体表达上调，诱导HSC活化并分化为成纤维细胞，导致分泌大量细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，加速ECM在肝内过度沉积，促进肝纤维化进展，但在其他因素引起的肝纤维化发病过程中EP4的作用还不清楚。本研究在CCL4诱导的小鼠肝纤维化模型，使用E7046拮抗PGE2与EP4结合，采用Western Blot、qPCR和病理学染色研究，发现E7046能有效改善小鼠肝功能和组织学变化、减轻肝纤维化程度，为探索阻断EP4与其配体结合以防治肝纤维化提供思路。
1.1 动物、药物、试剂与仪器 6～8周龄清洁级雄性C57BL/6小鼠30只，体质量为20±2 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司[许可证号：SCXK(京)2019-0008]。室温20～25℃，12 h昼夜交替。造模前禁食12 h，常规自由饮水。E7046(ER-886406)购自Selleck公司(货号S6649，美国)；
甲基纤维素(methylcellulos)购自Solarbio公司，货号M8070，中国；
四氯化碳购自北京化工厂，分析纯；
橄榄油购自成都市科龙化工试剂厂；
检测ALT和AST试剂盒购自Maccura公司，货号CH0101201和CH0101202，中国；
PrimeScriptTMRT试剂盒购自TaKaRa公司，货号RR037A，日本；
Power SYBR© Green PCR Master Mix试剂盒购自ThermoFisher公司，货号4368708，美国；
ECL发光检测试剂盒购自ThermoFisher，货号32209，美国。离心机(ThermoFisher公司)，全自动生化分析仪(Hitachi公司)，OLYMPUS显微镜和全自动酶标仪(ThermoFisher公司)，凝胶成像仪(Bio-rad公司，美国)。
1.2动物模型的制备 C57BL/6J小鼠30只，随机分为对照组、模型组和CCL4联合E7046组，(n=10)。在模型组，给予小鼠5%CCL4油溶液15 mL.kg-1腹腔注射，1次/3 d，连续27 d；
在CCL4联合E7046组，在造模的同时给予E7046阻断剂(30 mg.ml-1)100 μl灌胃，1次/3 d，连续27 d；
在对照组，给予5%橄榄油腹腔注射。在对照组和模型组，给予小鼠等体积0.5%甲基纤维素溶液(E7046溶剂)灌胃。各组小鼠在末次腹腔注射给药12 h后，麻醉处死，立即采集血清和肝组织，使用自动生化分析仪检测血清ALT和AST。取肝组织，10%福尔马林固定24 h，经脱水、透明浸蜡、包埋、切片，行HE、Masson和天狼星红染色，显微镜下观察。
1.3 肝组织蛋白检测 采用Western blot法，切取肝组织100 mg，各组内每3～4只小鼠肝组织形成一份混合样本，每组得到3份混合肝组织样本。裂解蛋白，提取组织总蛋白后，采用BCA法检测蛋白浓度，加上样缓冲液，变性蛋白，在SDS-PAGE凝胶电泳上进行蛋白分离、转膜，用5% BSA封闭1 h。加入抗EP4(1: 1000，Santa Cruz，sc-55596)、抗α-SMA(1: 1000，CST，#19245)、抗β-Actin(1: 2000，Cell Signaling Technology，#4970)，4℃摇床过夜，TBST洗脱5遍，加入辣根过氧化物酶连接的二抗(1:5000，北京友谊中联生物科技有限公司，P03S02)室温孵育1 h，TBST洗脱，ECL显影，曝光。
1.4 肝组织mRNA检测 采用qPCR法，取材同上。将每份混合样本放入研钵中，快速加入液氮，碾碎后，加入Trizol 1 ml，充分吹匀后，转入EP管中，室温静置5 min。通过RNA沉淀、洗涤、溶解、定量等步骤，反转录成cDNA。使用ABI 7500 Realtime-PCR仪进行qPCR，反应条件：50℃，2 min，1个循环；
95℃，10 min，1个循环；
95℃，15 s，60℃，60 s，40个循环。Ptger4的上游引物序列为：5’-CCATTCCCGCAGTGATGTTCA-3’，下游引物序列为：5’- TGCGCGACTTGCACAATACTA-3’；
Acta2的上游引物序列为：5’-CCCAGACATCAGGGAGTAATGG-3’，下游引物序列为：5’-TCTATCGGATACTTCAGCGTC
A-3’；
Col1a1的上游引物序列为：5’-GCTCCTCTTAGGGGCCACT-3’，下游引物序列为：5’-ATTGGGGACCCTTAGGCCAT-3’；
GapDH的上游引物序列为：5’-AATGGATTTGGACGCATTGGT-3’，下游引物序列为：5’-TTTGCACTGGTACGTGTTGAT-3’。应用2-△△Ct法计算相对基因水平。
2.1 各组肝组织EP4蛋白表达比较 模型组小鼠肝组织EP4蛋白表达比对照组显著增高，经E7046干预后，肝组织EP4蛋白表达降低(图1)；
同样地，模型组小鼠肝组织EP4编码基因Ptger 4 mRNA水平为(3.5±0.1)，显著高于对照组[(1.0±0.1)，P<0.05]，而CCL4联合E7046处理组为(2.4±0.2)，较模型组显著降低(P<0.05)。
图1 肝组织EP4蛋白表达情况(Western blot法)
2.2 各组血清肝功能指标比较 见表1。
表1 各组小鼠血清ALT和AST水平比较
2.3 各组肝组织病理学表现 对照组肝组织肝小叶结构和肝细胞正常；
模型组肝小叶被严重破坏，结构紊乱，细胞明显肿胀变形，有片状坏死和炎性细胞浸润(箭头)；
CCL4联合E7046组炎症程度和坏死区域较模型组明显减少，表现为坏死灶和炎性细胞浸润减少。模型组肝组织见大量胶原沉积(箭头头)，而在CCL4联合E7046组胶原纤维明显减少，肝纤维化明显改善(图2)。
图2 各组肝组织病理学表现 (HE、Masson和天狼猩红，100×)
2.4 各组肝组织肝纤维化分子标志水平比较 模型组小鼠肝组织α-SMA表达较对照组增高，而在CCL4联合E7046组α-SMA水平较模型组降低(图3)；
模型组小鼠肝组织Acta2和Col1a1 mRNA 水平较对照组显著上调，而CCL4联合E7046组则较模型组显著降低(P<0.05，表2)。
图3 各组小鼠肝组织α-SMA蛋白表达水平(Western blot法)
表2 各组小鼠肝组织Acta2和Col1a1 mRNA水平比较
肝纤维化是机体应对各种原因导致慢性肝损伤的一种修复反应，可导致胶原等细胞外基质(ECM)大量沉积[8，9]。本研究发现，CCL4诱导的肝损伤小鼠肝组织EP4表达明显增高。采用EP4特异性拮抗剂E7046溶液灌胃处理CCL4小鼠后，血清肝功能指标明显降低，肝组织炎性细胞浸润程度减弱，胶原沉积得到显著改善。同时，纤维化标志α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白Col1a1水平降低。本研究结果表明EP4受体在CCL4诱导的小鼠肝纤维化过程中发挥了重要作用，阻断EP4受体与其配体结合，能明显改善CCL4小鼠肝纤维化进程。本研究促进了对肝纤维化病理机制的认识，并为预防肝硬化和终末期器官衰竭提供了新的治疗靶点。
PGE2是花生四烯酸的代谢产物之一[10]。PGE2作为一个重要的促炎分子，通过与E型前列腺素受体(EP1-EP4)相互作用，触发胞内信号转导和调控，从而参与了多种疾病的发生发展[11]。EP4受体是一个高亲和力[12]的Gs蛋白偶联受体[13]，主要受配体激活后活化下游通路[14]。PGE2和EP4受体在多种人类肿瘤都有上调[15]。当EP4与PGE2或其他激动剂结合时，EP4动员Gs蛋白复合物分解成Gαs和Gβγ亚基，随后激活cAMP-ERK和PI3K等多种信号通路[14]。另外，EP4受体水平显著影响肿瘤的生长发育。通过多种机制过表达EP4可提高结肠癌细胞的存活率和肿瘤血管系统[16]。一项对细胞系和小鼠模型进行的研究证实，肝星状细胞(HSC) COX2-PGE2-EP4通路活化可导致胶原蛋白合成增多。体外实验使用EP4抑制剂AH23848能够抑制HSC的集聚，并阻止肝癌细胞的扩散[17]。
E7046是一个高度选择性的小分子EP4拮抗剂[7]。E7046通过选择性抑制EP4与其配体PGE2结合，对人骨髓细胞活化和分化具有明显的免疫抑制作用，并在体内和体外均表现出明确的抗肿瘤活性[6]。E7046具有可口服、生物利用度高的优势。2015年启动的一项临床试验(NCT02540291)研究E7046对进展期肿瘤患者的治疗作用。在晚期恶性肿瘤患者，每日一次口服E7046显示出可控的耐受性、免疫调节作用和疾病的稳定性[7]。这些研究为E7046治疗肝纤维化的临床应用提供了有价值的安全性依据。
防止肝纤维化的进展或促进其消退，改善肝功能，延缓肝硬化和失代偿期的发生，是治疗肝纤维化的根本目的[18]。以往，TGF-β被认为是重要的促肝纤维化细胞因子[19]，靶向TGF-β的药物吡非尼酮已开展多项治疗肝纤维化和肝硬化的临床试验[20]。然而，截至到目前仍缺乏有效的抗纤维化治疗方法[18]。本研究采用E7046证实EP4在CCL4小鼠肝纤维化进展过程中发挥重要作用。由于E7046可特异性拮抗PGE2与EP4结合，并且PGE2是EP4主要的内源性配体，因此本研究提示PGE2/EP4途径可能是肝纤维化的重要病理学发生机制之一。PGE2/EP4途径可能成为新的抗肝纤维化治疗靶点，值得进一步研究。
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