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李嘉文， 麻冬梅， 苏立娜， 张 玲， 侯汶君， 杭嘉慧
(宁夏大学西北土地退化与生态系统恢复省部共建国家重点实验室培育基地/西北退化生态系统恢复与重建教育部重点 实验室， 宁夏大学生态环境学院， 宁夏 银川 750021)
中图分类号：S544.9文献标识码：A
文章编号：1007-0435(2023)02-0396-08
Effects of Exogenous Melatonin on Oat Seedling Growth and Antioxidant System under Salt Stress
LI Jia-wen, MA Dong-mei*, SU Li-na, ZHANG Ling, HOU Wen-jun, HANG Jia-hui
(Cultivation Base of State Key Laboratory of Land Degradation and Ecosystem Restoration in Northwest China， Key Laboratory of Restoration and Restoration of Degraded Ecosystems in Northwest China， Ministry of Education， College of Eco-Environment， Ningxia University， Yinchuan， Ningxia 750021， China)
Abstract:Melatonin is an indoleamine growth hormone with multiple biological functions,as well as has an ability to regulate defense responses in plants under stress of adversity. The present study was conducted to explore the effects of exogenous melatonin on the phenotype,physiological indicators,enzyme activities and their related genes in oats (AvenasativaL.) seedlings under salt stress. This study was conducted in an artificial climate chamber and cultured by root irrigation to compare the changes in phenotypic indicators,osmotic regulatory substances,degree of membrane lipid peroxidation,antioxidant system activity,and expression levels of genes related to enzymes encoding antioxidants in ‘Baiyan7’ under the seven treatments of the single salt stress and combined treatment with salt and melatonin.The results showed that compared with salt stress,the plant height and root length of ‘Baiyan 7’ seedlings were significantly increased after the addition of exogenous melatonin,the membrane damage caused by oxidative stress was reduced,the expression level of lipoxygenase-related genes LOX was down-regulated,while osmotic imbalance was effectively alleviated;in terms of scavenging reactive oxygen species,the expression of related genes encoding antioxidant enzymes was up-regulated,the enzyme activity was significantly increased,and the activity of antioxidant system was significantly enhanced,which was most suitable at the added concentration of 150 μmol ·L-1.These results suggest that exogenous melatonin has an important role in alleviating salt stress to oats seedlings.
Keywords:Oat;Exogenous melatonin;Antioxidant system
土壤中含盐类物质如含盐矿物质和可溶性盐的累积会造成土壤盐渍化[1]。土壤盐渍化是广泛分布于全球的影响农牧耕作、经济发展的严峻问题，主要集中于降水量小于蒸发量的草原气候区。在我国，盐渍土沉积问题多年来一直备受关注，其影响范围甚广，西北地区如内蒙古、宁夏、甘肃等地的盐渍土沉积问题主要由漫灌等引起[2]。国内外有关农业发展的研究结果一致表明，盐胁迫引起氧化胁迫后，植物细胞的体内将会逐渐产生大量羟基自由基(OH-)和过氧化氢(H2O2)，即积累过量的生物活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，导致植物细胞ROS的产生和抗氧化系统具有的清除能力严重失衡，从而引起氧化损伤，是当前影响植物种群生存、耕种作物生长和农业产量水平的重要农业非生物逆境因素之一[3-4]。
ROS增加，会对植物体细胞及其它各种重要生理过程系统造成损伤，引起细胞凋亡造成植物死亡[5]。植物体在进化及演变发展过程中已经形成了一个比较完善的应激防御系统，来平衡活性氧的产生和清除。几乎存在于所有的细胞间室、胞浆、线粒体、胞外体和过氧化物酶体等的如超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化物酶(Peroxidase，POD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)等抗氧化物酶对清除活性氧具有重要作用[6-7]。
饲用燕麦(AvenasativaL.)是普遍种植于世界各地的优质牧草，为禾本科燕麦属一年生植物，因其突出的盐碱耐受性，不仅是很多国家都重要推广种植的粮饲作物，也是我国北方的和西北地区的传统优质耐盐碱饲料作物。相较于其他牧草作物，燕麦的盐碱耐受性使得它能够在更恶劣的土地生存，因此研究燕麦对于非生物胁迫下的植物防御机制是很有必要的。
褪黑素作为普遍存在于动植物细胞体内中的吲哚胺类生长调节素，在动物体内主要起调节昼夜节律等作用，其化学名称为N-乙酰-5-甲氧基色胺(C13N2H16O2)，英文缩写为MT。有研究表明，褪黑素可以在多种非生物胁迫条件下，如干旱[9]、盐害[10]、冷害[11]和重金属离子[12]等环境中增强植物的抗逆性。添加外源褪黑素能够促进根系和叶片对钙质元素的吸收，缓解盐胁迫下Na+,Cl-等植物对的毒害，增强植物的生存能力，调节高温加盐渍等环境下渗透物质的积累量，缓解渗透失衡，维持膜系统功能的相对完整。外源褪黑素在直接作为抗氧化剂的同时也能通过影响抗氧化酶的活性及其相关基因的表达量来增强植物对逆境的耐受性，还能调节内源褪黑素的含量及其合成相关基因COMT的表达量来促进防御反应的发生[13-18]。然而在饲用燕麦上，关于外源褪黑素的研究还很有限，因此本研究选用耐盐牧草饲用燕麦作为研究对象，以探究褪黑素对饲用燕麦的逆境调控能力和途径，为研究燕麦的耐盐性和褪黑素作用机制提供一定的理论基础。
1.1 材料的选择与预处理
根据查阅文献及耐盐性综合评价选择‘白燕7号’(耐盐)[19]作为本次的研究对象，筛选出种子颗粒大而饱满又具有自然生长发芽能力的优良种子，使用终浓度75%酒精消毒处理30 s，再使用稀释成0.1%的氯化汞溶液浸泡洗涤7 min，最后用无菌蒸馏水冲洗2～3次。
1.2 实验设计
本实验于2022年7月15日至8月20日在宁夏大学生态环境学院5楼人工气候室进行。将经过预处理后的种子再次挑选后，随机播种至32孔(4×8)的穴盘内，每个孔种5粒，播种当天浇1 L水，后每间隔3 d浇水。生长7 d后，挑选长势一致的幼苗移入水培盒(13 cm×9 cm×11 cm,六孔)，使用霍格兰营养液进行水培缓苗培养，每3 d更换营养液，7 d后挑选长势一致生长旺盛的幼苗进行处理。本次实验共设计7个不同处理，每个处理三次重复(表1)。CK为对照组，使用蒸馏水培养，不添加盐和褪黑素。盐与褪黑素复合处理采用盐溶液和褪黑素溶液1∶1添加。处理方法采用水培根灌。连续培养8 d，直至叶片边缘发黄，每隔3 d更换一次水培盒内的溶液。处理完毕后，使用鲜样进行生长指标、相对含水量、相对电导率的测量，然后取样放入—80℃冰箱，以备生理指标和qRT-PCR的测定。
表1 盐与褪黑素添加设计Table 1 The design for salt and melatonin addition treatments
1.3 指标测定
1.3.1生长指标 选择处理后的燕麦幼苗鲜样，株高、根长用卷尺测量并记录。
1.3.2生理指标 取-80℃冷冻保存的幼苗叶片，用硫代巴比妥酸法[20]测量丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量。使用烘干法测量相对含水量，取新鲜叶片称取鲜重并记录数据，后放入蒸馏水浸泡24 h称饱和水重并记录数据，放入60℃烘箱烘干，称取干重并记录数据，通过公式相对含水量=[(鲜重—干重)/(饱和重—干重)]×100%得到相对含水量数据。相对电导率使用浸泡法测量[21]。CAT，SOD，POD酶活性以及脯氨酸含量均按陈建勋[22]所述方法测量和计算。
1.3.3荧光定量qRT-PCR 从—80℃冷冻样本中称取0.1 g新鲜叶片，倒入液氮快速研磨成粉末后，利用TIANGEN总RNA提取试剂盒(RNAprep Pure Plant Plus Kit)，后使用(HiScript All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR)试剂盒将提取的叶片总RNA反转录合成cDNA。相关引物见表2，其中根据从小麦TrPrx(LOC606365)基因序列克隆得到AsPrx部分CDS序列设计引物，SOD和CAT相关基因的引物参考Nisha[23]的研究。每个样本设置3个技术重复，内参基因选择燕麦肌动蛋白基因Actin。使用Universal RNA ExtractionKit试剂盒进行qRT-PCR。PCR程序设置为：95℃3 min，95℃ 30 s，58℃ 15 s，72℃ 30 s，共35个循环，最后72℃延伸5 min。使用2-△△ct法计算相关基因的表达水平。
表2 引物设计Table 2 The qRT-PCR analysis primers
1.4 数据处理
本实验利用Excel 2021进行数据整理，使用SPSS 26进行数据分析，采用单因素方差分析(ANOVA)，Duncan检验(P<0.05)，使用origin 2021绘图。
2.1 外源褪黑素对盐胁迫下‘白燕7号’表型生长的影响
和蒸馏水处理的对照组相比，150 mmol·L-1盐胁迫使幼苗的株高(图2I)和根长(图2II)分别显著降低了27.3%和42.1%(P<0.05)。盐处理下，燕麦幼苗叶片边缘发黄较多，植物呈现萎蔫状态，叶片细长较为柔软(图1)。褪黑素能够有效缓解NaCl造成的生长抑制(P<0.05)，株高在褪黑素浓度200 μmol·L-1处理下增幅最大，达20.4%，但不同浓度处理之间的株高变化的差异性没有达到显著水平。根长在M1(50 μmol·L-1)处理下增幅最大，为34.8%，但各处理和褪黑素浓度变化没有线性变化关系。
2.2 外源褪黑素对盐胁迫下‘白燕7号’叶片渗透调节物质的影响
与CK(蒸馏水)组相比150 μmol·L-1盐处理下的幼苗叶片相对含水量降低了23.2%(图3I)(P<80.05)。不同浓度的褪黑素处理都能够缓解盐胁迫带来的渗透失水，其中在M3处理下缓解效果最佳，增加了25.8%。与CK(蒸馏水)组相比盐处理下脯氨酸含量显著增加23.5%(图3II)(P<0.05)。与单独盐胁迫处理相比,复合处理下的脯氨酸含量均显著提高，在M3处理下最佳，上升了46.8%。这表明盐胁迫会造成燕麦幼苗叶片内渗透失衡，褪黑素通过提高渗透调节物质的积累来维持渗透平衡，从而达到增强其对逆境盐胁迫下的耐受限度。
2.3 外源褪黑素对盐胁迫下‘白燕7号’叶片细胞膜透性的影响
盐处理方式下幼苗叶片的相对电导率比蒸馏水处理显著增加了62.3%(图4I)(P<0.05)，使其细胞膜透性增加。褪黑素能够有效降低盐胁迫下的电导率，在M3处理时效果最好，下降了27.9%。与蒸馏水处理相比，盐胁迫使幼苗叶片的丙二醛(MDA)含量显著增加(P<0.05)；
复合处理相比于胁迫处理的MDA水平显著下降(P<0.05)，不同褪黑素浓度处理之间有明显差异(图4II)，在M4处理时效果最好，下降了66.6%。这表明褪黑素能够有效缓解盐胁迫造成的燕麦幼苗细胞膜透性增加和膜脂过氧化程度升高，且与褪黑素浓度相关。
图1 幼苗表型生长状况Fig.1 Phenotypic growth status of the ‘Baiyan 7’ Seedling under different treatments注：CK为0 mmol·L-1 NaCl+0 μmol·L-1 MT；
N为150 mmol·L-1 NaCl+0 μmol·L-1 MT；
M1为150 mmol·L-1 NaCl+50 μmol·L-1 MT；
M2为150 mmol·L-1 NaCl+100 μmol·L-1 MT；
M3为150 mmol·L-1 NaCl+150 μmol·L-1 MT，M4为150 mmol·L-1 NaCl+200 μmol·L-1 MT；
M5为150 mmol·L-1 NaCl+250 μmol·L-1 MT。下同Note:CK denote as 0 mmol·L-1 NaCl+0 μmol·L-1 MT；
N 150 mmol·L-1 NaCl+0 μmol·L-1 MT；
M1 150 mmol·L-1 NaCl+50 μmol·L-1 MT；
M2 150 mmol·L-1 NaCl+100 μmol·L-1 MT；
M3 150 mmol·L-1 NaCl+150 μmol·L-1 MT，M4 150 mmol·L-1 NaCl+200 μmol·L-1 MT；
M5 150 mmol·L-1 NaCl+250 μmol·L-1 MT. The same as below
图2 各浓度下‘白燕7号’表型指标的变化Fig.2 Variations of the phenotypic indicators of the ‘Baiyan 7’ seedlings under different treatments注：数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同Note：Value columns with different lowercase letters mean significant difference (P<0.05). The same as below
图3 各浓度下‘白燕7号’透调节物质的变化Fig.3 Variations of permeable regulatory substances in ‘Baiyan 7’ seedlings under different treatments
图4 各浓度下‘白燕7号’细胞膜透性的变化Fig.4 Variations of cell membrane permeability of ‘Baiyan 7’ seedlings under different treatments
2.4 外源褪黑素对盐胁迫下‘白燕7号’幼苗叶片抗氧化系统的影响
150 mmol·L-1NaCl处理下的POD,SOD,CAT酶活性显著低于对照组(图5)(P<0.05)，在逆境盐胁迫下，‘白燕7号’幼苗叶片的抗氧化酶活性受到显著限制(P<0.05)。在5个复合处理方式下，三种抗氧化酶活性相较于单独盐处理都有明显增加(P<0.05)，其中在添加50 μmol·L-1外源褪黑素处理POD酶活性最高；
在添加100 μmol·L-1外源褪黑素处理SOD酶活性最高；
在添加150 μmol·L-1外源褪黑素CAT酶活性最高，三种抗氧化酶的最适外源褪黑素浓度各不相同，且抗氧化酶活性与褪黑素浓度之间没有显著的变化关系。
图5 各处理梯度的‘白燕7号’抗氧化系统活性Fig.5 Activities of antioxidant system of ‘Baiyan 7’ seedlings under different treatments
2.5 外源褪黑素对盐胁迫下‘白燕7号’幼苗叶片相关抗逆基因表达水平的影响
由图6可知，与蒸馏水处理的对照组相比，150 mmol·L-1NaCl处理下抗逆的相关基因表达水平都有显著变化(P<0.05)，其中编码三种抗氧化酶POD，SOD，CAT的相关基因表达水平分别下降了71.1%，58.3%，66.7%，表明高浓度的盐会抑制抗氧化酶相关基因的表达，编码脂氧合酶的相关基因LOX上调了173%，会使膜脂过氧化程度加剧。与单独盐处理相比，复合处理能够显著上调编码抗氧化酶基因的表达，增强抗氧化酶的活性，其中在M3处理时效果最佳。复合处理下脂氧合酶相关基因LOX的表达也有显著下调，表明添加褪黑素能有效缓解盐胁迫下膜系统的损伤，维持其正常功能。
图6 各处理梯度下‘白燕7号’抗氧化酶相关基因与LOX基因表达水平变化Fig. 6 Variation of the genes expression related to the antioxidant system in the ‘Baiyan 7’ seedling leaves under different treatments
盐胁迫是阻碍燕麦幼苗正常生长的重要非生物胁迫因子之一。本研究表明在150 mmol·L-1盐胁迫下‘白燕7号’幼苗的表型生长受到了抑制，株高及根长都显著降低，叶片萎蔫，边缘发黄。李彦等[24]研究同样表明盐胁迫限制植物正常发育速度，降低体内组织和器官的生长和分化效率。本研究显示盐胁迫处理对幼苗造成渗透胁迫，叶片内的相对含水量显著降低，脯氨酸含量显著上升，幼苗的渗透压平衡失调，使其吸收养分的能力下降；
同时盐胁迫造成幼苗体内的相对电导率和MDA含量上升，引起膜系统损伤，膜透性升高，这与Koyro等[25]的结论具有一致性。Chen等[26]的研究也表明当盐浓度在150 mmol·L-1时，燕麦的抗氧化系统的工作效率受到限制。
外源褪黑素的添加能显著提高燕麦幼苗在盐胁迫情况下的生长能力，与单独盐胁迫相比，盐与褪黑素复合处理下的燕麦幼苗的株高和根长的生长得到显著改善，这与熊毅等[27]的研究结果具有相似性，但本研究表明褪黑素浓度的变化并不会引起叶片幼苗生长指标的显著变化。
本研究结果显示褪黑素能够显著缓解盐胁迫引起的燕麦幼苗叶片的渗透调节失衡，提高相对含水量和增加脯氨酸的积累。游离脯氨酸作为植物体内一种重要的渗透调节物质[28]，在盐胁迫过程中，赖氨酸能够转化为脯氨酸、氨基丁酸等其他氨基酸。本次研究显示，在褪黑素的调节作用下，脯氨酸积累量增加，这表明更多的赖氨酸进行了转化，以此缓解盐胁迫带来的渗透失衡，在施加浓度为150 μmol·L-1外源褪黑素时效果最佳，这与Zhang等[29]在小麦中的研究结果一致。在本研究中，盐胁迫导致幼苗叶片的丙二醛含量和相对电导率显著上升，从而造成膜系统受损。褪黑素有利于保护植物体细胞在外界非生物胁迫环境下能维持细胞膜功能的相对完整性，保障细胞结构的稳定性来提高植物的抗逆性[30]。相对电导率和丙二醛(MDA)水平与细胞膜结构的稳定性呈现负相关性，当植物体内二者水平较高时表明其膜系统受盐胁迫的损害严重，本研究中，与盐胁迫相比，复合处理下的叶片内的丙二醛和相对含水量显著降低，表明添加外源褪黑素能够缓解盐胁迫对燕麦幼苗叶片在细胞结构、细胞膜和细胞壁的损伤，增加脯氨酸的积累，从而减缓逆境对植物的生理和生长抑制。
在植物的非生物胁迫中，ROS的过度积累会破坏细胞膜的通透性和完整性，同时ROS也作为信号分子激活抗氧化系统[31]。盐胁迫能够使燕麦幼苗叶片内的细胞产生应激反应，通过细胞外物质和质膜蛋白的互作，胁迫信号由膜上受体率先感知，产生的Ca2+和ROS作为二级信使，来激活叶片内相关的防御基因和抗氧化系统，本研究中复合处理与单独盐胁迫处理相比，幼苗叶片抗氧化系统的活性显著提高，编码脂氧合酶的相关基因LOX表达水平下调。脂氧合酶能催化产生膜脂过氧化物，是茉莉酸积累的重要调节因子，与MDA途径不同，通过信号转导途径参与胁迫反应，在本研究中叶片内LOX基因在复合处理下表达量下调揭示茉莉酸(JA)信号通路可能也参与了褪黑素介导的盐应激反应，这与褪黑素能够通过多种调节方式影响植物的抗逆性这一结果具有一致性[32-33]。本研究中与单独盐胁迫相比，复合处理下叶片内抗氧化酶活性及其相关基因的表达水平都显著提高，这表明褪黑素在ROS含量增加时不仅能直接作为抗氧化剂清除过量的ROS，还通过增加抗氧化酶活性和抗氧化酶基因的表达，来提高盐处理下燕麦幼苗的生理活性[34]。褪黑素也能通过影响细胞信号的传导以触发氧化还原反应来增强细胞的抗氧化防御机制，胁迫处理如干旱、高盐等会促进H2O2和OH-的产生，本研究中对幼苗进行盐胁迫时，产生大量ROS，抗氧化系统因高浓度的盐造成清除能力受到抑制，而复合处理下，褪黑素能够使编码抗氧化酶SOD，CAT，APX等的基因表达水平上调，来缓解ROS的损害。植物中的Ⅲ类Prxs可以通过转移不同供体的电子来催化过氧化循环中H2O2的还原[35]。ROS的主要产生场所是具有高强度代谢活性和电子流速率的线粒体、叶绿体和过氧化物酶体等，本研究中与单独盐胁迫相比，复合处理下定位于线粒体和细胞壁中[8]且具有高底物特异性的过氧化物酶Prxs的相关基因AsPrx表达水平上调，增强了过氧化物酶活性，增强了燕麦幼苗的抗逆性，这与Zhang[36]发现IbPrx基因的高表达能够增强甘薯在逆境生长条件下的过氧化物酶活性和降低H2O2的含量研究结果具有相似性。
盐分会阻碍燕麦幼苗的正常生长，限制其表型发育，添加不同浓度外源褪黑素均可以显著缓解，在50 μmol·L-1浓度下效果最佳。同时外源褪黑素有利于提高脯氨酸含量以维持渗透平衡，保护膜系统，下调了LOX基因表达水平，降低膜脂过氧化程度，上调了编码抗氧化物酶POD，SOD，CAT基因的表达水平，提高抗氧化剂POD，SOD，CAT酶活性，提高‘白燕7号’清除活性氧的能力，在M3处理即150 μmol·L-1时综合效果最佳。本研究对进一步了解褪黑素对燕麦缓解盐胁迫的作用机制具有一定的参考意义。
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