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林海敏 党胜春 郄吟吟 胡 蓉
胰腺癌的发生率和病死率呈现逐年上升的趋势[1]。胰腺癌患者中90%的病理类型是胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)，胰腺癌患者可手术率只有20%，5年生存率低于5%，1年生存率约17%，目前在成人肿瘤中仍是预后最差的一种[2～4]。
从20世纪90年代起陆续建立了各种肿瘤细胞体外药敏模型，包括细胞株移植瘤模型(cell-line-derived xenograft，CDX)及人源肿瘤异种移植(patient derived tumor xenograft，PDTX)模型等用于肿瘤个体化治疗药效学检测。《胰腺癌综合诊治指南(2018版)》提出，PDTX模型在胰腺癌中的应用为胰腺癌个体化诊疗提供思路[5]。PDTX很好地保留了患者原始肿瘤的基本特征、瘤内微环境、组织病理、遗传及表型方面的特征，因而能较好地预测药物的反应性[6～9]。
G蛋白信号调控因子2(G-protein signaling modulator 2，GPSM2)属于GPCR家族。最初发现GPSM2在维持细胞纺锤体的正确定位、确保细胞对称性分裂、参与细胞分裂的G2/M期调控发挥着重要作用[10～13]。笔者团队前期研究表明，GPSM2在胰腺癌组织中过表达，且其表达程度与胰腺癌浸润、转移、肿瘤分化类型及预后有一定相关性[14]。本研究在设计PDTX模型验证模型可行性的同时，亦旨在验证以GPSM2作为目标靶的药物是否能够抑制PDTX模型胰腺癌细胞、组织的生长。
1.材料：Trizol试剂、MTT购自上海碧云天生物技术有限公司。蛋白酶抑制剂及BCA法蛋白含量检测试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司。羊抗兔IgG+HRP、羊抗鼠IgG +HRP 购自美国Jackson公司。兔抗-ki-67(ab16667)、兔抗-PCNA(ab92552)购自英国Abcam公司。RPMI 1640培养基及FBS够自美国Gibco公司。羊抗兔IgG+HRP购自常州中美歆新生物科技有限公司，SYBGRE PCR MasterMix购自美国Invitrogen公司，sh-GPSM2慢病毒包装购自和元生物技术(上海)股份有限公司，Tween-20购自中国BBI生命科学有限公司，BSA蛋白标准品购自加拿大Fermentas公司，PVDF膜购自美国Bio-Rad公司。5例胰腺癌组织样本取自2019年1月～2020年12月入选标准为中国临床肿瘤学会胰腺癌诊疗指南手术实施R0切除的患者，胰腺癌分期类型参照UICC/AJCC TNM 2017分期系统[5，15]。
2.胰腺癌PDTX模型的建立：选取4～6周龄体质量30g左右的裸鼠于SPF级屏障环境中，实验前饲养3天以上适应基本环境[实验动物许可证号：SYXK(苏)2013-0036]。从手术中获取入组患者肿瘤标本组织后，迅速保存在低温的RPMI 1640培养基(其中含20%胎牛血清和0.05%链霉素)中，并尽快移植到小鼠体内。移植前剔除肿瘤标本中坏死、破碎的组织，将品相良好组织分割为约2mm×2mm×3mm大小，麻醉小鼠后，将处理好的肿瘤块移植到小鼠皮下及肾囊膜，缝合切口。将剩余的组织进行石蜡块包埋。待移植瘤长到合适大小后，进行取瘤、移植传代。脱臼法处死荷瘤鼠后，将小鼠置于75%乙醇中浸泡2min，手术获取肿瘤组织后，接种方法如上所述。重复上述步骤，至第3代后，待瘤体长至100～200mm3适时进行试验，使用3～7代进行药物实验。
3.动物体内药物敏感度测试：使用第3～7代的体质量约为30g胰腺癌PDTX模型小鼠进行疗效评价实验，当荷瘤小鼠瘤体体积为100～200mm3时，将小鼠使用随机区组法随机分为对照组、sh-GPSM2组(sh-GPSM2慢病毒，50mg/kg)和5-氟尿嘧啶(fluorouracil,5-FU)化疗组(20mg/kg)，每组各5只，瘤内给药，每次溶剂剂量为1.5ml，每3天1次，治疗2周。药物干预2周之后，评估给药组与对照组的相对肿瘤抑制率(tumor growth inhibition，TGI)，计算方法为：TGI=1-T/C，T/C代表给药组的瘤体体积/对照组的瘤体体积。小鼠的体质量、体积每3天测量1次，小鼠肿瘤体积每3天测量1次。体积计算方法为：肿瘤体积(V)=(长径×短径2)/2。
4.RT-qPCR检测：使用Trizol试剂从对照组、sh-GPSM2组药物干预18天后的新鲜荷瘤中提取总RNA，分离提取mRNA后，采用三步法进行RT-qPCR，以GAPDH为内参。引物序列详见表1。采用相对定量进行统计学分析处理，采用RQ=2-△△CT法计算GPSM2的相对表达量。
表1 RT-qPCR所使用的引物序列
5.Western blot法检测：分别取对照组、sh-GPSM2组化疗18天后的新鲜荷瘤各5个，剪碎，取适量组织加入500μl的基础裂解液30min裂解，在冰上离心后取上清，紫外分光光度计测定细胞裂解液蛋白浓度，加入上样缓冲液，煮沸制备蛋白样品，-80℃冰箱保存。配置好电泳胶后上样蛋白样品缓冲液混合液、70V电压电泳、100V冰水混合浴中转膜、洗膜后一抗4℃孵育12h、TBST(即TBS+Tween)漂洗3次5min洗膜、二抗常温孵育12h后同样洗膜3次，通过ECL Reagent显影后扫膜，使用Image J软件测量灰度值，再进行统计学分析。
6.流式细胞术检测：①胰酶消化细胞，离心后去上清，使用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)清洗；
5×105个细胞量的悬液离心去上清，加入100μl的缓冲液中重悬；
加入Annexin V和7-AAD各5μl，室温避光孵育15min；
加入400μl的结合缓冲液，低温避光保存，1h内上机检测；
②将单细胞悬液2ml离心，弃上清；
加入PBS洗涤、离心，再次弃上清；
4℃下70%乙醇固定30min后离心，弃上清；
PBS洗涤，再次离心；
于500μl PBS中加入RNase A，37℃孵育30min，离心；
用PBS洗涤，离心后加入PI于500μl PBS中，室温避光孵育30min后进行检测。
1.PDTX模型及肿瘤体积、重量变化：PDTX模型成功建立(图1A)，sh-GPSM2组抑癌率为66.61%，5-FU化疗组的抑癌率为72.76%(图1B)。3组干预6天后，每3天再评估，发现sh-GPSM2组、5-FU化疗组肿瘤生长受抑制。5-FU、sh-GPSM2组干预后，模型肿瘤体积明显缩小(P<0.001)。小鼠体内肿瘤组织对sh-GPSM2制剂、5-FU反应性良好，且抑制肿瘤作用比较，差异无统计学意义(图1C)。在sh-GPSM2、5-FU化疗组与对照组间，实验小鼠肿瘤瘤体的重量比较，差异有统计学意义(P<0.001，图1D)。
图1 小鼠模型、瘤体与参数A.小鼠胰腺癌PDTX模型；
B.药物干预后18天后各组瘤体组织标本；
C.药物干预不同天数各组平均肿瘤体积；
D.药物干预18天后各组平均肿瘤重量。与对照组比较，*P<0.001
2.RT-qPCR检测应用sh-GPSM2制剂对GPSM2基因表达的影响：使用了sh-GPSM2制剂的实验组较对照组中的胰腺癌肿瘤细胞GPSM2基因表达水平明显下降(P<0.001，图2)。
图2 对照组及sh-GPSM2组的GPSM2相对表达水平
3.Western blot法检测肿瘤组织中周期相关蛋白ki-67、PNCA表达水平：sh-GPSM2组、5-FU化疗组与对照组比较，与对照组间ki-67、PNCA表达，sh-GPSM2、5-FU化疗组的ki-67、PNCA的表达被抑制(P<0.05，图3)。
图3 Western blot法检测周期蛋白表达对比A.使用Western blot法检测不同分组肿瘤周期相关蛋白的表达情况；
B.各组目标蛋白的相对表达水平
4.流式细胞术检测PDTX肿瘤细胞凋亡和周期：5-FU化疗组、sh-GPSM2组在S期的细胞百分比明显升高，说明sh-GPSM2制剂能抑制细胞周期于S期(P<0.01，图4中A、B)；
对照组肿瘤细胞早期凋亡较少，5-FU化疗组、sh-GPSM2组肿瘤细胞早期凋亡比例增加(P<0.01，图4中A、C)。
图4 流式细胞术检测细胞凋亡与周期及统计分析A.流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡和周期；
B.各组早期凋亡细胞百分比；
C.各组停留于S期细胞百分比
PDTX能够在同一时间内对多只鼠移植同一来源的肿瘤组织并保持肿瘤特征，也可以通过获取不同发展阶段的肿瘤建立对应阶段的肿瘤模型，进行不同时期肿瘤细胞、分子改变所导致的肿瘤转移、复发机制和耐药性机制的研究[16]。PDTX能客观模仿患者原发肿瘤，能够比较好地还原患者原发病灶的微生态环境、肿瘤性质等，因此可针对特定的肿瘤筛选最合适、有效的抗肿瘤药物[17]。
国内外多篇文献报道，GPSM2与多种肿瘤的发生、发展关系紧密，包括肝癌、肺癌、乳腺癌[18～21]。笔者团队前期的研究表明，GPSM2高表达的胰腺癌预后较差。本研究在建立模型的同时，利用在体胰腺癌动物PDTX模型，以GPSM2为切入点，验证GPSM2作为治疗靶标的可行性，sh-GPSM2制剂的实用性及抗耐药性值得期待。
本研究中RT-qPCR检测结果说明sh-GPSM2制剂能够抑制GPSM2的表达水平，类似靶向药物抑制PDTX模型个体肿瘤的生长，这与PDTX模型肿瘤对sh-GPSM2反应效果有相关性，sh-GPSM2制剂能够使PDTX模型胰腺癌肿瘤体积缩小、重量下降，抑制PDTX模型个体肿瘤的生长。而对照组肿瘤体积增大更快、肿瘤增重更快，对照组的周期相关蛋白ki-67、PNCA表达都较sh-GPSM2组高，sh-GPSM2制剂与5-FU能够抑制周期相关蛋白的表达。sh-GPSM2组的肿瘤细胞停留于S期细胞比例增多，且早期凋亡细胞比例增多，推断这两种药物干预均能够对PDTX胰腺癌细胞的细胞周期有抑制作用，能够促进癌细胞早期凋亡。验证了GPSM2能够促进肿瘤细胞增殖，参与细胞周期调控，GPSM2在参与细胞分裂的G2/M期发挥了重要的功能。
本研究建立了胰腺癌患者病理来源的PDTX模型，使用药物治疗后，可反映治疗药物对胰腺癌肿瘤的影响，通过分析PDTX模型裸鼠的肿瘤生长速度、体积、周期相关基因及蛋白表达、细胞凋亡等情况，对治疗药物的有效性做出判断。使用sh-GPSM2制剂靶向治疗可显著抑制PDTX模型中胰腺癌细胞的生长，sh-GPSM2制剂可能作为一种新型胰腺癌靶向化疗药物等待开发，但是其具体的不良反应需要进一步的实验研究。另外，后期研究中，共同应用sh-GPSM2制剂与5-FU、胰腺癌靶向治疗药物、常规化疗药物如吉西他滨等进行研究，检测它们是否有协同作用，以获得更好的胰腺癌治疗方案，在低剂量药物治疗、更少的不良反应同时获得更好的疗效。在将来临床应用过程中，本实验能指导胰腺癌患者在需要化学干预早期就筛选出有效性、安全性最佳的治疗方案。
综上所述，胰腺癌模型中的GPSM2高表达者增长速度较快，抑制GPSM2的表达可以抑制PDTX模型肿瘤的生长。故而可以在病患确诊胰腺癌早期，使用PDTX模型筛选、验证sh-GPSM2制剂这种药物的有效性，通过对PDTX模型治疗后反应的监测，以及对模型中细胞的一系列增殖情况的研究，获得的结果能指导建立sh-GPSM2制剂敏感的胰腺癌患者的个体化诊疗方案。
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