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王海宇 谢方瑜 吕 梅 李文利 张巍巍 姜大磊 马志浩 王晓娟 王鹤鸣 解祥军
胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是一种恶性程度较高的消化道肿瘤，其发生率及病死率逐年上升，总体5年生存率仅为9%，是目前美国肿瘤相关死亡的第四大原因[1]。手术切除是PC有效的治疗方式，仅有15%～20%的患者有条件接受手术切除[2]。糖类抗原19-9(carbohydrate antigen19-9, CA19-9)是目前监测PC有效的生物学标志物，其在胆管癌、胃癌、结肠癌等肿瘤中均会升高，在一些胆胰良性疾病中出现假阳性结果，及5%～10%的Lewis阴性表型出现假阴性结果，不推荐作为PC诊断的生物学标志物，因此迫切需要探索有高敏感度和特异性的新型非侵入性生物学标志物用于PC诊断[3～7]。微小RNA(microRNA，miRNA)是长度为17～25个核苷酸的非编码RNA，研究发现，miRNA可以作为肿瘤抑制基因或癌基，有致癌和抑癌功能的miRNA的异常表达与癌症的发生、发展有关[8, 9]。本研究通过对3个GEO数据集进行整合分析，筛选出血清中上调的miRNA(miR-1290)，探讨血清miR-1290对PC患者的临床诊断价值。
1.一般资料：收集2019年9月～2021年11月青岛大学附属青岛市市立医院收治的35例PC患者(PC组)，患者年龄38～89岁，平均年龄为65±11岁。同期收集23例胰腺良性疾病患者，包括慢性胰腺炎15例、胰腺导管内乳头状黏液瘤5例、胰腺神经内分泌肿瘤3例，为胰腺良性疾病(benign pancreatic disease controls，DC)组，患者年龄29～80岁，平均年龄为61±12岁。20例健康志愿者为健康对照(healthy controls，HC)组，年龄40～72岁，平均年龄为57±11岁。纳入标准：(1)PC组：①临床确诊为PC；
②临床病理资料完整。(2)DC组：①穿刺确诊为良性或腹部CT、MRI确诊为良性；
②未合并其他类型疾病；
③临床病理资料完整。(3)HC组：无肝胆胰疾病史、无其他系统疾病、无恶性疾病。PC组排除标准：①合并有细菌性感染等急性感染性疾病；
②有恶性肿瘤病史；
③严重的心肌梗死、脑梗死等严重疾病；
④采血前接受过手术、放化疗、免疫治疗。本研究经青岛大学附属青岛市市立医院医学伦理学委员会审批(伦理学批号：2022临审字第004号)，患者知情理解并签署知情同意书。
2.生物信息学筛选差异血清miRNA：为探索PC中差异表达的miRNA，通过GEO数据库获得PC血清样本的微阵列数据集，对GSE113486、GSE106817和GSE55139数据集的PC患者及非癌患者的血清miRNA表达谱进行了综合分析，筛选出PC患者血清差异表达上调的miRNA，采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)测定分析选定的miRNA在本研究样本中的血清表达情况。
3.标本收集及样本保存：留取各组清晨空腹外周静脉血5ml，3500r/min，离心10min，吸取上清液移至EP管中，-80℃条件下保存备用。
4.RT-qPCR检测：取300μl血清，使用TRNzol试剂[天根生化科技(北京)有限公司]从血清中提取总RNA，NanoDrop测定RNA浓度和纯度，A260/280为1.8～2.0，应用miRNA cDNA第一链合成试剂盒(广州复能基因有限公司，批号：QP013)进行反转录形成cDNA，得到cDNA产物后进行RT-qPCR反应，反应混合液由PCR试剂Green Preix Ex Taq Ⅱ(2X)(日本TaKaRa公司，批号：RR820A)配制，放于ABI 7500型荧光定量PCR仪中进行反应，miR-1290的引物序列：上游引物：5′-TGGATTTTTGGATCAGGGA-3′，下游引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；
内参U6：上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，PCR循环条件：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 34s，共进行40个循环，每个样品重复3次。按照2-△△ct计算miR-1290的相对表达量。
5.血清CA19-9水平检测：试剂购自上海罗氏制药有限公司，酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)测定其水平。
6.统计学方法：应用SPSS 25.0统计学软件对数据进行分析。计量资料以中位数(四分位数间距)[M(Q1，Q3)]表示，组内两两比较采用Mann-WhitneyU检验。采用多因素Logistic回归分析评价PC发生的影响因素，受试者操作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲线和曲线下面积(area under the curve，AUC)用于评估使用miR-1290及CA19-9作为诊断标志物区分PC患者与良性胰腺疾病患者和健康个体的诊断价值，以P<0.05为差异有统计学意义。
1.miR-1290在GRO数据集分析中表达上调：本研究对3个GEO数据集(GSE113486、GSE106817和GSE59856)进行了PC和非癌患者血清miRNA表达谱的全面比较分析。选取3个数据集中前50个表达异常的miRNA，通过WEEN在线数据分析取交集后获得Venn图，发现与健康者比较，PC患者血清中只有miR-1290显著上调，因此，本研究选择血清miR-1290作为后续分析的生物学标志物，详见图1。
图1 Venn图
2.各组血清miR-1290表达水平比较：PC组、DC组和HC组的血清miR-1290表达水平分别为0.51(0.37，0.85)、0.14(0.05，0.28)、0.08(0.04，0.22)，PC组表达水平明显高于DC组和HC组，差异均有统计学意义(z值分别为-4.554、-4.672，P均<0.05)。
3.血清miR-1290水平与肿瘤临床病理特征相关性分析：在PC患者样本中，Ⅲ期和Ⅳ期患者miR-1290表达上调且明显高于Ⅰ期和Ⅱ期患者，此外，miR-1246的表达水平与淋巴结转移、远处转移之间存在显著相关性(P均<0.05，表1)。
表1 胰腺癌患者血清miR-1290水平与肿瘤临床病理特征相关性分析[M(Q1，Q3)]
4.血清miR-1290、CA19-9及miR-1290联合CA19-9检测胰腺癌的诊断价值：绘制ROC曲线，评估其对PC的诊断能力，血清miR-1290、CA19-9诊断PC的AUC值相似，但miR-1290检测的敏感度优于CA19-9。miR-1290联合CA19-9检测对区分PC组与HC组的敏感度为85.7%、特异性为87.0%；
区分PC组与HC组的敏感度为91.4%、特异性为85.0%；
区分PC组与所有对照组的敏感度为85.7%、特异性为90.7%。miR-1290联合CA19-9检测在区分PC组与DC组、PC组与HC组、PC组与所有对照组的AUC分别为0.929(95%CI：0.866～0.992)、0.959(95%CI：0.913～0.996)和0.942(95%CI：0.895～0.989)，联合检测对于PC患者的效能显著高于单一指标的诊断效能，详见表2、图2。
图2 血清miR-1290、CA19-9诊断胰腺癌的ROC曲线分析A.PC组与DC组；
B.PC组与HC组；
C.PC组与所有对照组；
所有对照组包括DC组和HC组
表2 血清miR-1290、CA19-9诊断胰腺癌的ROC曲线分析
5.PC发生影响因素的多因素Logistic回归分析：多因素Logistic回归分析结果显示，与DC组比较，吸烟(≥10年，≥10支/天)、饮酒(≥10年，≥25g/d)及血清中miR-1290高表达是影响PC发生的因素(P均<0.05)；
年龄(≥ 60岁)、性别均与PC发生不相关(P均>0.05，表3)。
表3 胰腺癌发生影响因素的多因素Logistic回归分析
PC是世界上较为致命的疾病之一，发生率逐年持续升高，PC起病隐匿、恶性程度高、病情进展快，大多数患者确诊时已处于晚期，失去手术机会，预后极差，早期手术治疗可明显改善预后[10]。目前影像学检查和病理学检测是PC的主要诊断手段，但影像学检查无法早期检测病情，胰腺穿刺活检是诊断PC的金标准，但胰腺穿刺活检是一种侵袭性操作，临床应用有一定的局限性[11]。因此，迫切需要探索有高敏感度和特异性的新型非侵入性生物学标志物用于PC诊断，为患者提供手术机会，改善预后。CA19-9诊断PC的敏感度及特异性较低，不适合用于PC筛查诊断。研究表明，miRNA可以作为肿瘤抑制基因或癌基因，是癌症诊断和治疗的潜在靶点。此外，其有高度保守性、组织特异性及在体液中良好的稳定性，使得通过miRNA检测分析有可能成为疾病检测的手段[9]。研究显示，肿瘤特异性miRNA联合血清CA19-9的生物学标志物可用于PC诊断[12]。CA19-9与miRNA生物学标志物的联合检测比单个CA19-9检测可以提高诊断的准确度[12]。
研究表明，miRNA在PC中差异表达，由于研究分析之间的miRNA谱可能存在不一致性，本研究对3个GEO数据集进行了整合分析，发现血清miR-1290在PC患者中显著上调。文献报道，miR-1290在肺癌、乳腺癌、胃癌、大肠癌等肿瘤组织中呈高表达，在PC组织及细胞系中表达亦上调，且在培养的肿瘤细胞系中的上清miR-1290的表达水平随着细胞密度和培养时间的增加而增加[13～17]。因此推断miR-1290可作为新生物学标志物预测并筛查PC[18]。既往研究表明，在PC组织miRNA的差异表达研究中，Li等[19]研究发现，原发性浸润性胰腺导管腺癌细胞中的miR-1290高于正常胰腺导管，表明血清miR-1290表达来源于PC组织细胞。为了进一步评估血清miR-1290水平升高的来源，Li等[19]通过定量分析胰腺miR-1290的表达，证实原发性PC细胞中miR-1290表达升高，且高于正常胰腺导管组织。另有研究表明，在PC肿瘤切除后，血清miR-1290表达水平较术前明显降低[20]。在胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)中，核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)在大部分PC患者中被激活，通过IκB激酶复合物1(I-kappa B kinase complex, IKK1)与KRAS的突变相关联。Ta等[21]的细胞研究表明，miR-1290作为癌基因发挥作用，可能通过直接靶向IKK1的3′-非翻译区成为癌基因，IKK1沉默增强了PC细胞的增殖、侵袭能力。研究证明，miR-1290可以通过抑制FOXA1/2的表达，从而促进PDAC的恶性进展，FOXA1/2参与上皮间质转化[22]。与此同时，陈自力等[17]研究表明，通过使用miRNA-1290抑制剂处理PC细胞，抑制PC细胞的侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶2及环氧化酶2的表达，减弱了PC细胞的侵袭及转移。上述研究表明，miR-1290参与了PC发生、发展过程中的广泛生理和病理过程。所以本研究筛选出血清中上调的miR-1290，探讨血清miR-1290及联合CA19-9对PC诊断的临床价值。
本研究结果显示，PC组中血清miR-1290表达水平与DC组及HC组比较显著上调，与既往研究结果相一致，可作为PC诊断的血清生物学标志物。多因素Logistic回归分析结果显示，血清miR-1290相对高表达是影响PC发生的危险因素，且本研究中PC临床病理资料分析显示，miR-1290升高与肿瘤T分期、淋巴结转移、远处转移相关，提示血清miR-1290可能与PC的侵袭、转移密切相关。基于本研究，利用ROC曲线评估miR-1290、miR-1290联合CA19-9检测对PC的诊断价值，结果表明，miR-1290对诊断PC的AUC值及敏感度均优于CA19-9，特异性与CA19-9相似，提示miR-1290可作为CA19-9的补偿性循环肿瘤标志物诊断PC。miR-1290联合CA19-9检测PC的AUC值明显优于单一的miR-1290、CA19-9检测，敏感度高于任一单一指标检测，提示miR-1290、CA19-9联合检测对诊断PC有较高的临床应用价值。
综上所述，miR-1290在PC患者血清中表达水平显著升高，联合检测miR-1290、CA19-9能提高诊断PC的准确性，诊断效能高于任一单一指标。血清中miRNA提取方便且易检测，因此，miR-1290可能作为PC诊断的循环肿瘤生物学标志物，但本研究存在一些局限性，如样本量相对较小，miR-1290的表达水平在PC组织样本中未得到验证，今后需要扩大样本量进一步验证，并验证PC组织中其表达量。
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