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张辉，毛群颖 综述，梁争论，徐苗 审校
中国食品药品检定研究院，北京 102629
严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引发的新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）严重威胁人类健康和公共卫生安全。截至 2022 年 6 月，SARS-CoV-2 感染已造成全球超过600 万人死亡［1］。接种疫苗对有效控制疫情具有重要作用，全球已有150 多个SARS-CoV-2 疫苗进入临床试验阶段，38 个获批紧急使用或上市，我国有34个疫苗进入临床试验阶段，5 个获批附条件上市［2］。目前全球已接种SARS-CoV-2 疫苗118.5 亿剂次，我国33.9亿剂次［1，3］。随着SARS-CoV-2值得关注变异株（variants of concern，VOC）不断出现，其传染性和免疫逃逸功能增强，导致现有疫苗有效性均有不同程度下降，需研发新一代更有效的变异株疫苗或广谱疫苗［4-5］。
中和抗体水平是评价疫苗免疫原性的主要指标，但至今尚无标准化的SARS-CoV-2 中和抗体检测方法，不同实验室和不同产品之间的中和抗体水平难以进行横向比较，严重制约疫苗和抗体类治疗药物的研发和评价。因此，2020年9和12月，我国及世界卫生组织（World Health Organization，WHO）先后建立了第一代SARS-CoV-2 抗体中国国家标准品和WHO国际标准品（international standard，IS），为SARSCoV-2 疫苗研发和评价提供了关键标准物质［6-8］。但随着两个第一代标准品售罄及VOC 的不断出现，2022年，WHO 与我国又同步开展了第二代标准品的研制工作。本文就WHO 和我国SARS-CoV-2 抗体标准物质的研制及应用进展作一综述。
1.1 定义及分类 标准物质是一种确定了具有一个或多个足够均匀特性值的物质或材料［9］。作为分析测量行业中的“量具”，在校准测量仪器和装置、评价测量分析方法、测量物质或材料特性值、考核分析人员的操作技术水平及在生产过程中产品的质量控制等领域发挥重要作用。标准物质是具有特性量值的准确性、均匀性、稳定性和传递性的实物形式计量标准。生物制品标准物质可分为一级（IS）、二级和三级标准物质［10-11］。其中，一级标准物质是由WHO 生物标准化专家委员会指定国际单位（international unit，IU）的最高级别标准品，用于次级标准品的量值溯源；
二级标准物质为全球区域性或国家级标准物质，用于标定三级标准物质和分析检测；
三级标准物质为企业标准物质，用于实验室检测和仪器定标等。WHO 建议应建立二级标准物质标准品，用于大量的SARS-CoV-2 抗体检测或三级标准物质的标定，以保证限量的WHO 标准品用于维持量值溯源的稳定性和持续性。
1.2 WHO 指南 为规范生物制品标准物质的研制和分发，WHO 制订了《WHO 国际和其他生物制品标准物质制备、特性描述和建立的建议》《国家和其他二级疫苗标准物质建立手册》和《用于传染病核酸或抗原检测的体外诊断实验二级参考物质的制备手册：与 WHO 国际标准校准》［10，12-13］。由于 SARS-CoV-2 疫苗及抗体类治疗制品研发和应用的大量需求，2022年又颁布了《WHO 抗体检测用二级标准品制备手册》和《WHO 新冠病毒抗体二级标准品制备手册》，指导全球抗体类二级标准品的研制和应用［11，14］。
1.3 研制基本要求 《WHO 抗体检测用二级标准品制备手册》和《WHO 新冠病毒抗体二级标准品制备手册》中均明确提出，抗体类标准物质是一类用于检测抗体样本生物活性（如由抗体亚群所致的中和能力或结合能力）的标准物质［11，14］。标准物质的关键属性包括可追溯性、不确定度（measurement uncertainty，MU）、赋值方法、稳定性、可交换性和生物负荷（无菌）等。一级标准品通常采用国际认可的指定值表示，因此，仅二级、三级标准品的标定值具有可追溯性和MU。可交换性是指标准物质是否适合于所检测的样品类型，应在协作标定时加入不同类型的样品进行评估。基于标准品原材料的同质性、安全性的要求及对突变株的考虑，对相应标准品的制备、协作标定、结果统计和赋值也提出了具体要求。WHO 提出应依据领域内有经验的机构（如WHO 协作中心）的建议组织协作标定，并需获得领域内专家和统计学专家支持。应尽量由多个实验室参加，参加实验室应具备相关经验。检测方法可采用不同检测方法进行协标外，还应尽可能提供一个统一的方法和标准操作程序（standard operation procedure，SOP），全部方法均应经验证，并预设实验成立的接受标准。
标准品标定的统计分析应尽量采用平行线法或曲线法，WHO、《欧洲药典》（10. 0 版）和《美国药典》（USP35-NF30）对此均有专项描述［15-17］，应使用适宜的统计模型进行数据分析，并对每次独立检测进行统计模型有效性检验。在二级标准品与IS 赋值时，应首先评估两者对数剂量-关系的线性和平行性，证明两者具有相近的生物学特性。同时还提出二级标准品的标定值应包括MU，可用95%可信限表示，MU应具有方法特异性等要求。
2.1 第一代SARS-CoV-2抗体WHO IS的建立 SARSCoV-2 疫苗和抗体治疗药物的研发急需建立可靠的分析方法进行抗体检测和评估。IS 的建立可有效促进SARS-CoV-2 抗体检测方法的标准化，提高各实验室间检测结果的可比性和一致性，对确定疫苗和治疗药物所需的有效抗体水平开展流行病学调查及效果评价等具有重要意义。因此，WHO及时启动了SARSCoV-2抗体IS研究［7-8］。研究选取11位COVID-19患者恢复期血清制备候选标准品（NIBSC code：20／136），由高效价捐献血浆制备候选参考品（NIBSC code：20／130）。来自15 个国家的51 个实验室参加了本次协标研究，共采用ELISA（总抗体、IgG、IgA 和IgM）、活病毒中和、假病毒中和、流式细胞术、免疫层析、抑制试验和双抗原结合等共125 个检测方法进行了协作标定。协作标定样品包括候选标准品1 份，高、中、低效价、低S／高N（S 蛋白低应答／N 蛋白高应答）和阴性候选参考品各1 份、4 份临床样本（即高、低滴度COVID-19 患者恢复期血浆和血清各2 份），共计10 份不同类型样品用以评估20／136 作为国际标准品的适用性。协作标定结果显示，20／136是抗体效价最高的样品之一；
采用20／136 为标准计算样品的相对效价，对于多数阳性样品可有效降低各实验室间结合抗体与中和抗体检测结果的检测差异，收窄实验室间的四分位数范围，提高检测几何均值／中位数＜2 的实验室比例；
但对于2 份低效价样品，相对效价未显著改变各实验室间的检测差异，这可能是由于低效价样品接近于各种方法的检测阈值，实验室间检测差异较小所致。对于中和抗体检测，在ELISA 法中，20／136 降低实验室间检测差异的作用更明显。由于不同ELISA 法中采用的单位不同，实验室间检测结果差异可达10 000 倍，当采用统一单位时，可显著提高各实验室间检测结果的可比性。对于全部检测方法，大多数实验室对5 份参考品的检测结果均得到相同的高、中、低排序，表明该候选参考盘适用于所有检测方法。
将候选标准品赋值1 000 国际单位（IU）／mL 计算样品的IU 值，结果表明，低效价样品的结合抗体和中和抗体的IU 几何均值相近，但高效价样品结合抗体的IU 几何平均值是中和抗体的2倍。可能是由于与其他样本比较，20／136结合抗体含量高于中和抗体含量所致，表明虽然候选标准品适用于中和抗体和ELISA 结合抗体检测，但中和活性与结合活性存在一定区别。在二级标准品溯源时，应对不同检测方法分别进行溯源赋值。
2020 年 12 月，经第 73 届 WHO 生物标准化专家委员会（The Expert Committee on Biological Standardization，ECBS）会议讨论，批准 20／136 为第一代SARS-CoV-2 抗体国际标准品（250 IU／安瓿），批准20／150（高效价）、20／148（中效价）、20／144（低S，高N）、20／140（低效价）和20／142（阴性）为第一代SARS-CoV-2抗体国际参考盘，不赋予国际单位。
2.2 第一代SARS-CoV-2 突变株抗体国际参考盘的建立 第一代SARS-CoV-2 抗体IS 和参考盘的建立对统一和协调全球范围内疫苗和治疗产品的相关抗体检测发挥了重要作用。自2020 年底，更具传染性的SARS-CoV-2 VOC不断出现，对现有疫苗和抗体类药物的有效性提出了严峻挑战。为促进针对不同VOC 抗体检测方法的发展，支持疫苗和药物的持续开发，WHO计划建立含有不同VOC的国际抗体参考盘［18］。经第 74 届 ECBS 讨论确定开展新一代 SARSCoV-2 突变株抗体国际参考盘的研制项目。该项目采取WHO、流行病预防创新联盟和英国国家生物制品检定所（The National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）合作的形式开展，以建立包含5个VOC抗体参考品为目标，将主要用于活病毒中和抗体检测，而不再应用于以结合抗体类检测为主的诊断试剂。目前该项目已获得了3 个不同VOC（原型株、Alpha 和Delta 株）的恢复期血浆或血清原材料，其他两个VOC 的恢复期血浆或血清尚在收集中，一旦新VOC出现，该参考盘将进行灵活调整。
2.3 第二代SARS-CoV-2 抗体WHO IS 的建立 由于第一代SARS-CoV-2 抗体IS 的需求较大，至2021年8 月库存已告罄，急需建立第二代WHO IS。因此在 2021 年 10 月 的 第 74 届 ECBS 会 议 上 ，讨 论 并通过了第二代WHO IS 的研制申请（WHO／BS／2021.2411）［19］。经讨论确定，基于当前 SARS-CoV-2疫苗免疫的抗体效价较高，且VOC不断出现，第二代WHO IS的原材料选择首先应采用更高滴度的SARSCoV-2疫苗免疫或恢复期血清及血浆进行研制，理想情况是第二代IS 对现有的VOC 均呈现高滴度；
其次，考虑到原材料变化可能带来的影响，原材料应尽可能与第一代WHO IS相似，并使用相同的中和抗体测量系统进行评估；
制备量至少应达5 000 安瓿以上，以满足SARS-CoV-2疫苗、治疗药物和流调需求。
在第一代标准物质应用中发现，由于标准物质在结合抗体类检测方法的不恰当应用，可能会导致国际单位的混乱和误解。因此，第二代IS 明确为基于中和抗体的IU，而对于针对不同抗原的结合抗体检测，将被指定一个新结合抗体单位（BAU），以确保该国际单位的性质和定量准确；
同样，对于可能出现的VOC，将根据协作标定结果为每个VOC 计算并指定数值。
3.1 第一代国家标准品的建立 我国是开展SARSCoV-2 疫苗研发最早的国家之一，具有研发类型多、企业多、临床试验多等特点。为满足我国SARS-CoV-2疫苗免疫原性评价的需求，在第一代IS建立之前，我国于2020 年9 月建立了第一代国家SARS-CoV-2 中和抗体标准品［6］。该标准品采用我国COVID-19 患者恢复期血浆制成，由包括国家质控实验室在内的11 个实验室开展了协作标定研究，研究采用活病毒和假病毒检测方法对包括国家标准品在内的5 份样品进行协作标定检测，结果显示，采用国家标准品计算相对效力可有效降低各实验室间检测差异，提升不同实验室和不同疫苗之间中和抗体检测准确性和可比性。2020年9月，该标准品通过了我国国家药品监督管理局生物制品标准委员会的批准，成为我国第一代SARS-CoV-2中和抗体标准品，赋值1 000 U／mL，用于SARS-CoV-2 假病毒中和抗体检测。由于该标准品的建立早于第一代IS，未能将其溯源至国际单位（IU）。同期，我国还另建立了国家SARS-CoV-2血清参考盘（SARS-CoV-2 IgM 和IgG 抗体检测试剂国家参考品：370096、370097），用于结合抗体类诊断试剂的质量控制［20］。
3.2 第二代国家标准品的研制 与WHO IS 相同，我国第一代国家标准品也得到了广泛关注，需求量较大，于2021 年迅速售罄。为确保我国疫苗、治疗药物的研发，并与WHO IS 进行量值溯源，我国于2021年底采用COVID-19 患者恢复期血浆和免疫球蛋白分别制备了2个候选标准物质，联合国内9家主要临床检测实验室进行协作标定，目前已完成协作标定和稳定性研究。
WHO 和我国第一代SARS-CoV-2 抗体标准物质对支撑全球范围SARS-CoV-2 疫苗和抗体类药物研发，对抑制疫情蔓延均发挥了重要作用，但具有高传染性和免疫逃逸能力的SARS-CoV-2 VOC流行，对全球范围疫情的控制造成了巨大挑战。为满足新一代疫苗、治疗药物研发的需求，WHO 正在积极收集不同VOC 感染者的血清样本，以研究建立灵活组合的第二代标准参考血清盘。我国SARS-CoV-2 疫苗和治疗性抗体药物研发企业多，研究建立标准物质对满足疫苗和药物研发需求具有重要意义，需在进一步收集筛选不同VOC感染者血清样本的基础上加强国际合作，加快我国新一代SARS-CoV-2抗体标准品的研制进程。
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