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李小杰 谭冬 杜玉民 袁宇
河北大学附属医院神经外科（河北保定071000）
癫痫是一种常见的神经系统疾病，由于神经元网络畸形或受到创伤性、感染性或代谢紊乱的影响时，大脑的局部或全脑会出现异常的同步神经元放电，就会导致癫痫发作；
以反复发作和不可预知的发作为其特点［1］。脑微透析技术的产生使其可以用来测量癫痫发作前、中和后兴奋性和抑制性神经化学物质浓度的变化，并与电生理数据相关联，促进了癫痫研究的突破［2］。随着脑微透析技术的不断发展，包括分段流、快速液相色谱（LC）和激光诱导荧光毛细管电泳（CE-LIF）等方法的应用，使微透析的时间分辨率明显提高到1 分钟以上，可用于测量癫痫发作相关的瞬时自发神经化学变化。已开发出比传统探针小得多的微型取样探针，具有更大的空间分辨率，它们可以针对癫痫研究中重要的特定脑区进行监测。将微透析取样与光遗传学和光刺激神经递质的释放相结合，也对研究癫痫发作起到了一定效果。本文就目前改进时间分辨率的脑微透析技术、微型化取样探针、光遗传学结合脑微透析技术作一综述。
脑神经化学物质在各种神经过程中发挥着非常重要的作用，包括脑神经元之间的神经信号传播、神经系统功能的维持以及促进神经元细胞的生长和修复［3］。因此，神经化学物质的失调可能导致多种脑部疾病，例如癫痫、帕金森病、阿尔茨海默病、脑水肿和脑缺氧等［4］。由于脑神经化学物质在神经系统中的重要性，脑神经化学物质检测开始广泛研究，以便于更好地了解脑神经传递和生理功能。脑微透析技术因此应运而生。脑微透析技术是一种可以对脑细胞外间质液进行采样的有创性技术，它能够连续检测脑细胞外间质液的化学成分。脑微透析装置由探针、导管、微量灌流泵、样品收集器和分析仪组成；
探针由流入管、流出管和中空纤维管构成，根据脑立体定位图谱，可借助脑立体定位仪植入；
脑微透析床旁分析仪可以将采样流体（也称为微透析液）每小时分析一次，其工作原理基于酶促反应［5］。我们可以用来检测癫痫发生时大脑中如NF-κB 和IL-6 等蛋白含量的变化［6］，亦能够观察如使用左乙拉西坦和奥卡西平等抗癫痫时引起的神经化学物质改变［7-8］。然而，由于分析的数据具有滞后性，其时间分辨率不高［9］。因此，需要有效和及时地测量微透析液来预测癫痫的发生和变化。为了实现这一点，新兴的研究将脑微透析技术改进，有效地提高了其时间分辨率和检测范围，使癫痫的研究更加精确和清晰。
传统的脑微透析技术上只能够在5～10 min的间隔里对脑细胞外间质液进行采样分析。限制时间分辨率的关键取决于所用分析方法的灵敏度，即必须在一定时间内收集足够的样品才能有足够的材料进行分析［9］。使用能够提高灵敏度的方法，如激光诱导荧光毛细管电泳技术（CE-LIF）和快速液相色谱技术（FLC）等，可以提供更好的时间分辨率［10］。
2.1 激光诱导荧光毛细管电泳技术激光诱导荧光毛细管电泳技术（CE-LIF）在监测3-巯基丙酸（3-MPA）诱发癫痫的神经化学变化的研究显示出了较高时间分辨率的潜在效用［10］。利用CE-LIF 技术可以在“快”（60 s）和“慢”（5 min）时间尺度上测量谷氨酸和GABA 的变化［10］。CRICK 等人利用CE-LIF 技术分析3-巯基丙酸（3-MPA）癫痫大鼠模型脑部快速1 分钟微透析采样的氨基酸/神经递质数据，观察到一个独特的趋势，谷氨酸显示出了双相活性。在5～25 min 内，谷氨酸明显增加，40～65 min 再次增加。在实验的最后30 分钟，谷氨酸也持续增加。60 s 取样结果表明，3-MPA 引起的谷氨酸变化呈双峰型，而在“慢”5 min 取样的时间尺度下这种双峰变化并不明显［10］。
癫痫持续状态通过利用激光诱导荧光毛细管电泳技术（CE-LIF）的脑微透析采样获得了相对较高的时间分辨率的结果，这在将来可以为难以预知的癫痫发作和自发性癫痫的发作提供新的见解。
上述研究结果表明，时间分辨率的提高可以更好地揭示癫痫发作背后的化学变化。在不久的将来，随着技术的进步，我们可以更清晰地研究导致癫痫发作的神经化学变化，甚至更高分时间辨率的神经化学变化（如每一秒的变化），借此可以揭示更多关于神经化学模式的信息。
2.2 快速液相色谱技术（FLC）由于自发性癫痫的发作是随机的［11］，因此利用连续的高时间分辨率的方法会对监测自发性癫痫的发作起到很大作用。最近，一些实验小组报告了与微透析相结合的快速液相色谱技术（FLC）的发展，这种技术可以连续、在线操作对一些抗癫痫药物进行长达1 分钟时间甚至更长时间的连续检测［12-13］。快速液相色谱技术（FLC）对高效液相色谱的透析液流通路进行了细致地优化并且用到了高灵敏度的电化学或光电化学检测器，并且在透析液中加入了稳定试剂，这种新技术已用于监测大鼠纹状体中甲基苯丙胺在自由活动的动物体内代谢过程中的多巴胺及血清素的变化［14］。由于时间分辨率的提高，可以更加精确研究局部甲基苯丙胺的代谢产物变化以及受药物影响的多巴胺水平。
这种技术的一个重要特点是它们可以进行连续操作和检测，因此有可能检测到未预测或自发性的神经化学物质的瞬时变化。例如，利用快速液相色谱技术（FLC）连续测量自由活动小鼠脑微透析液一项研究显示，该技术可以在7 min 内同时分析小鼠微透析液中的单胺、其前体和代谢物以及乙酰胆碱（ACh）、胆碱（Ch）和γ-氨基丁酸（GABA）等物质的变化，并能够测定特定大脑区域的基础神经递质水平，从而检测疾病相关和药物诱导的神经化学改变［15］。同时快速液相色谱技术（FLC）也可以用来测量5-羟色胺转运体（SERT）和性别差异介导刺激的5-羟色胺的水平［16］。因此，利用快速液相色谱技术（FLC）可以对癫痫的发作进行连续监测，能够捕捉到其发作相关神经化学物质的连续变化及影响这些物质水平因素的相关机制进行更进一步的研究。
2.3 微量液滴快速毛细管电泳技术（DFCE）目前微量液滴快速毛细管电泳技术（DFCE）可以使时间分辨率达到几秒钟以内［17］。如此高的时间分辨率有助于更好地描述导致癫痫发作的神经化学动力学。但要达到足够高的灵敏度，则必须面对在几秒钟的时间间隔内收集样本的技术挑战，如果微透析灌注速率为1 μL/min，则该几秒种间隔的收集的样本量相当于纳升的体积［18］。收集这种小样本的一种方法是采用分段流体取样，其中样本与不混溶的流体穿插，以形成小样本阵列进行分析［19-20］。
微量液滴快速毛细管电泳技术（DFCE）技术的出现显著提高了微透析的时间分辨率。该技术通过利用一个含有不相容载体相（全氟萘烷/PFD）的微型聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片上的三通通道将透析液分段成纳升栓［21］。微透析液通过单个样品栓（即纳升栓）的荧光测量的时间明显小于非样品栓测量的时间［21］，从而达到提高时间分辨率的目的。
为了进一步推进时间分辨率的界限，电喷雾电离质谱（ESI-MS）技术与微量液滴快速毛细管电泳技术联用，可以在5 秒的时间分辨率内对体内的乙酰胆碱进行监测［22］。此外，将2 nL 体内的微透析液组分在纳升塞中收集并利用这种联合技术进行神经化学监测时，时间分辨率可以达到2 s［23］。因此，微量液滴快速毛细管电泳技术将会是一种理想的方法，可以将微透析取样的时间分辨率提高到亚分钟的时间尺度，以测量随机自发性癫痫发作期间的神经化学变化。
为了在癫痫发作期间利用微透析进行神经化学测量，我们必须要监测特定的大脑区域，如海马区和核重聚体［24］。传统的微透析探针由于体积较大，无法单独针对这些脑区。大尺寸的探针也会导致脑组织损伤，在这种损伤的情况下也可能导致测量结果与自发性癫痫的发作产生的结果相混淆［25］。最新的研究进展是使探针微型化。这意味着我们需要从中枢神经系统（CNS）的较小区域中获得化学信息，而不影响中枢神经的神经化学恢复。这种小损伤并能获取化学信息的方式可以通过推挽灌流取样探针得到。这种微型化探针采用较低流量的流速采样，使组织损伤最小，体外回收率相对较高［18］。微型化探针能够测量活体小鼠大脑神经核团中的神经递质变化，具有较高的空间分辨率［26］。此外，这种微型化探针比常规微透析探针产生的组织损伤更低［18］。这类探针在行为学研究中的效用在动物实验里得到了证明，在利用微型化取样探针在研究大鼠恐惧等行为发生时，可以记录到大鼠海马和基底外侧杏仁核中细胞外锌的水平升高［27］。因此，将微型化探针与高时间分辨率监测技术相结合对神经化学物质的研究很有潜力［28］。
硅晶体推挽灌流探针的产生促使探针进一步小型化，更加适用于癫痫的研究［29］。这种微型化探针包含两个20 微米的通道，其出入端是注射或收集液体（缓冲液/透析液）的端口，通过活体麻醉大鼠脑取样，我们可以看到这种低流量推挽取样探针的效用：该技术联合液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术进行分析，硅晶体推挽灌流探针以50 nL/min 的速度在活鼠纹状体取样，通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术能够从推挽灌流液中检测出17 种神经递质及其代谢产物［29］。硅晶体推挽灌流探针还可以将透析薄膜嵌入硅晶体探针其中，这样就可以直接从这种类似大小的探针中进行微透析取样［30］。这种微型化制造的微透析探针在对麻醉动物的苯丙胺给药的动态体内化学变化的监测上与传统的微透析探针具有相同级别的表现，其在20 min 内检测到的14 种神经化学物质与传统微透析探针检测到的结果一致，由于这种探针的横截面积比传统的微透析探针小79%，这使得它们可以用于小型的动物模型和较小的大脑区域［30］。因此我们可以利用这些微型探针对较小的大脑区域如下丘脑和脑核重聚体进行高空间分辨率的测量，通过微透析取样来测量癫痫引起的神经化学变化，将会是研究癫痫的一种理想方法。
光遗传学是另一种可以用于癫痫研究的技术。光遗传学技术可以使用光来控制或监测神经元活动，这些神经元已经被基因修饰可以表达光敏离子通道蛋白［31］，可以用于癫痫模型的研究。在癫痫模型的研究中，光遗传学技术已成为抑制过度活跃神经元的重要工具，同时也可以刺激其他神经元可控地操纵癫痫发作［32］。无论是对兴奋性主要细胞的光遗传学抑制，还是对海马神经元中GABA（γ-氨基丁酸）能细胞亚群的激活，都可以在光照下迅速阻止癫痫的发作［33］；
此外，光遗传学技术通过刺激谷氨酸能神经元亦能够在存在完整的GABA 能传递的情况下触发癫痫样活动［34］。这可以为诱导和减轻癫痫发作提供一种可控的方法。
光遗传学技术与脑微透析取样结合神经化学监测的一些挑战包括神经化学技术的专业知识、能够实现高采样及分辨率的分析方法，并利用光遗传学技术控制来确定激光或热能对非靶向内源性离子通道或生物化学物质的影响［35］。这两种技术的结合将会使人们能够更彻底地了解潜在的神经回路及其对神经行为的影响，比如癫痫。联合微透析的光遗传学探针可以用于癫痫研究中光遗传学神经元刺激期间的神经化学监测，能够测量受控癫痫发作期间、之前和之后的神经化学物质的变化［36］。这可以显示出神经化学生物标志物与癫痫发作和复杂行为状态的相关性，进而更好地对癫痫的发作进行研究［36］。然而，光遗传学技术与微透析取样相结合的研究范围相当有限，因为目前它不能与电生理学和光刺激期间观察到的行为变化相结合［35］。因此光遗传学技术与微透析技术结合需要进一步的研究和改进。
脑微透析技术对于癫痫的发作机制及预测的研究仍在不断完善和更新，随着更高时间分辨率技术的出现以及微型化探针的改进，将更好地对癫痫的发作进行预测。同时利用光遗传学技术控制神经元的兴奋性产生可控的癫痫模型，并与脑微透析技术相结合，可以用于研究神经化学生物标志物与癫痫发作和复杂行为状态的相关性，从而进一步研究癫痫背后的机制，并为癫痫的治疗做出更好地调整。
【Author contributions】YUAN Yu：Conceptualization，Writing-Revewing and Editing.LI Xiaojie：Writing-Original draft preparation.TAN Dong：Writing-Revewing and Editing.DU Yumin：Writing-Revewing and Editing.All authors read and aplproved the final manuscript.
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