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[摘要] 目的 筛选中华大蟾蜍抗肿瘤活性物质，检测其抗肿瘤活性。方法 本实验通过凝胶过滤层析及高效液相色谱法，从皮肤分泌物中分离出具有抗细菌、抗肿瘤活性的物质，即中华大蟾蜍抗菌肽。以大肠癌细胞为体外实验模型，通过细胞形态学、MTT实验，研究中华大蟾蜍抗菌肽对SW480细胞的杀伤和生长抑制作用。结果 经过分离纯化得到较纯的活性物质，即中国大蟾蜍抗菌肽。通过细胞形态学观察到中华大蟾蜍抗菌肽作用组中细胞的数量明显的减少，细胞明显皱缩，成圆形，死细胞增多。MTT实验表明，中华大蟾蜍抗菌肽对SW480的生长抑制作用随着浓度的增加而加强。结论 本实验成功筛选到中华大蟾蜍抗菌肽，并检测其在体外对SW480具有抑制生长作用。
[关键词] 中华大蟾蜍；抗菌肽；生长抑制
[中图分类号] R73-34 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2011）36-24-03
Growth Inhibiting Effect of Antibacterial Peptides in Bufo Gargarizans on Cancer Cells
CHEN Liping HE Lili BA Yunfei
Department of Neurology，the People"s Hospital of Dehui City in Jilin Province，Dehui 130300，China
[Abstract] Objective To screen the Bufo bufo gargarizans cantor active materials，and test its antitumor activity. Methods The Bufo bufo gargarizans cantor-antimicrobial peptides was separated and purified by gel filtration chromatography and HPLC. The colorectal cancer SW480 was used as the model in vitro. The cell morphology and MTT were accepted to study the lethal effect and growth inhibiting of Bufo bufo gargarizans cantor-antimicrobial peptides to SW480. Results It indicated that a species of Bufo bufo gargarizans cantor-antimicrobial peptides was got through gel filtration chromatography and HPLC. The number of cells reduced，and the shap of the cells become shrinkage round significantly treated by Bufo bufo gargarizans cantor-antimicrobial peptides. The more Bufo bufo gargarizans cantor-antimicrobial peptides added，the more lethal effect and growth inhibiting effection was showed up by MTT. Conclusion The experiment is successful in screening Bufo bufo gargarizans cantor-antimicrobial peptides，and testing the role of inhibition of growth to SW480 in vitro.
[Key words] Bufo bufo gargarizans cantor；Antimicrobial peptide；Growth inhibiting
抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是生物免疫系统产生的一类抵抗外界病原体感染的多肽，广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内。抗菌肽是一种小肽，分子量一般小于10kDa，仅仅包含12～50个氨基酸，由基因编码、核糖体合成[1-3]。抗菌肽一般可以形成α-螺旋和β-折叠，抗菌肽的α-螺旋结构具有完美的水脂两亲性[4]，此结构是决定抗菌肽抗菌活性的基础。它除有非特异性的抗细菌、真菌、病毒等病原体外，还有抗肿瘤细胞的作用，特别是对多重耐药菌和肿瘤细胞有杀伤作用，而不破坏人体的正常细胞，是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药，是目前抗病原微生物药物开发研究中的一个热点。1980年，Boman等科学家在惜古比天蚕蛹的体内纯化到一种被称为cecropin[5]的昆虫抗菌肽，1987年，从光滑爪蟾的皮肤中分离纯化得到magainin蛙皮抗菌肽。迄今为止，研究者已从两栖类动物皮肤中筛选到1000余种抗菌肽[6]，而以天然抗菌肽作模板进行人工合成的模拟肽已达数千种。
本实验通过对中华大蟾蜍进行乙醚刺激，生理盐水收集其皮肤分泌物，利用凝胶过滤层析及反向高效液相色谱两种方法，分离纯化皮肤分泌物中的抗细菌、抗肿瘤活性物质，并对其抗细菌、抗肿瘤活性进行初步活性检测，以期筛选出新的抗细菌、抗肿瘤药物，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物、细胞及菌种 中华大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans cantor）两栖纲（Aves）、无尾目、蟾蜍科、蟾蜍属族，本试验材料购自市场。大肠埃希氏杆菌E.coli ATCC25922、金黄色葡萄球菌S.aureus ATCC25923均由本实验室保存；大肠癌细胞SW480由吉林大学中日联谊医院馈赠。
1.1.2 实验仪器 凝胶过滤柱（长100cm，直径25mm）、高速离心机（Eppendorf）、真空冷冻干燥机（FD-1-50）、KTA explorer100（GE）、制备型反相高效液相色谱LC-8A（岛津）、C18半制备柱（ACE）、超纯水机（ROP-100）和自动板式酶标仪ZS-2。
1.1.3 实验试剂 SephadexG-25填料购自GE公司；Na2HPO4-
NaH2PO4，pH6.0；三氟乙酸（Sigma，HPLC级）；乙腈（Merck，HPLC级）；超纯水（含0.1％TFA）；乙腈（含0.1％TFA）；MTT，DMSO均购自Sigma公司；MEM培养基、MH固体培养基均购自于TaKaRa公司。
1.2 实验方法
1.2.1 中华大蟾蜍皮肤分泌物的收集 活体中华大蟾蜍30只，用超纯水充分冲洗皮肤，放入密闭容器中，乙醚刺激2～3min，中华大蟾蜍皮肤表面可见泡沫状物质从皮肤分泌出来，立刻用生理盐水冲洗，收集冲洗液，12000r/min离心20min，0.22μm滤膜过滤，冷冻干燥后，放入-40℃低温保存。
1.2.2 凝胶过滤层析半纯化抗菌肽 将SephadexG25柱装好后，用超纯水以1.0mL/min的流速冲洗2～3倍柱体积。再用流动相（Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0）以3.0mL/min的流速平衡2～3倍柱体积。在215nm、280nm波长下监测，上样及洗脱在SephalexG25色谱柱平衡后，加样品溶液1～2mL，用流动相溶液以3.0mL/min的流速进行洗脱，将每个峰分别收集，以S.aureusATCC25923作为实验样品检测的指示菌，药敏片法检测各收集峰的抑菌效果。
1.2.3 制备型反相高效液相色谱纯化抗菌肽 样品经凝聚过滤层析后，收集具有抗菌活性的物质并将其真空冷冻干燥，然后溶于含0.1%三氟乙酸水溶液中，然后用10000转离心5min，吸取上清液弃沉淀，接着把上清液过0.22μm的滤膜。A液为含0.1％三氟乙酸的超纯水，B液为含0.1％三氟乙酸的乙腈。流速设置为2mL/min，每次上样2mL，根据色谱曲线中的色谱峰，分步收集各峰的样品，并记录时间，以S.aureus ATCC25923作为实验样品检测指示菌，检测各峰的抑菌活性，将具有抗菌活性物质即中国大蟾蜍抗菌肽真空冷冻浓缩。
1.2.4 癌细胞杀伤作用 将大肠癌细胞SW480用DMEM培养基加上10%胎牛血清培养在96孔板中，浓度为5×105cell/孔，终体积为100μL，过夜培养12h。我们将抗菌肽样品经过0.45μm滤器过滤，并将其浓度稀释为0.1mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL，作用于SW480细胞（抗菌肽组），24h显微镜观察结果，与空白对照组对比癌细胞变化情况。
1.2.5 对SW480细胞的生长抑制作用 多肽对肿瘤细胞增殖的抑制作用是用MTT-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）2，5-diphenyl tetrazolium romide测定的[7-10]。我们将大肠癌细胞SW480用DMEM培养基加上10%胎牛血清培养在96孔板中，浓度为5×103cell/孔，终体积为100μL，贴壁培养24h，培养条件温度37℃，5%的CO2，湿度95%。把中华大蟾蜍抗菌肽用PBS充分溶解，不同浓度的多肽与肿瘤细胞共培养24h（多肽在96孔板中最终浓度为0μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，40μg/mL，60μg/mL，80μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL），并且每个浓度要有三个平行孔。吸掉培养液，然后加入100μL的DMEM培养基和20μL的MTT（浓度为5mg/mL）继续培养4h。然后吸掉上层培养液后加入150μL的DMSO后，震荡10min后，用酶标仪在570nm下测量其吸光度值。
2 结果
2.1 分离纯化结果
皮肤分泌物的粗提物经过凝胶过滤层析纯化后，以280nm为监测波长，收集各峰，并以S.aureusATCC25923作为实验样品的指示菌，药敏片法检测抑菌活性峰，确定其中4号峰为活性峰。利用制备型反向高效液相色谱，C18反相色谱柱继续对凝胶过滤层析活性峰作进一步的分离，以215nm作为监测波长，收集各峰，同样以S.aureusATCC25923作为实验样品的指示菌测定各收集峰的抑菌活性，最终获得中华大蟾蜍抗菌肽。图1为粗提物凝胶过滤层析及高效液相色谱分离图；图2为凝胶过滤层析（左）、高效液相色谱（右）活性峰的抑菌结果。
2.2 对SW480杀伤作用
将中华大蟾蜍抗菌肽作用于大肠癌细胞SW480，倒置显微镜下观察，对照组的细胞结构完整，而在抗菌肽组中，当抗菌肽浓度达到0.1mg/mL时细胞结构发生明显的变化，细胞变小、变圆，折光率变大，细胞整体明显皱缩，边缘不光滑，细胞间隙明显增大，漂浮的死细胞增多，且伴有细胞碎片的悬浮。当抗菌肽浓度达到0.3mg/mL、0.5mg/mL时，看不到细胞存在（图3）。
2.3 MTT实验结果
不同浓度抗菌肽组作用于大肠癌细胞48小时后，其抑制率曲线如图4所示。中华大蟾蜍抗菌肽对大肠癌细胞SW480细胞有生长抑制作用呈现量-效关系。当中国大蟾蜍抗菌肽的浓度达到60μg/mL大肠癌细胞SW480细胞开始有抑制作用，当浓度达到200μg/mL时抑制率幅度增长缓慢，在浓度（10～40）μg/mL时并没有变现出抑制作用。
3 讨论
两栖动物抗菌肽的抗癌作用机理比较复杂[11]，目前主要以细胞骨架损伤学说为主，认为抗菌肽对正常的哺乳动物细胞和肿瘤细胞均具有损伤作用，但由于哺乳动物细胞骨架完整，且修复快，故抗菌肽对其不造成最终损伤，而肿瘤细胞骨架不完整，当被抗菌肽作用以后，得不到及时有效的修复而导致最终损伤。还有研究者认为抗菌肽可以从细胞膜、线粒体、核膜、细胞核染色体DNA、溶酶体等几个方面影响癌细胞的生存[12]，且能调动机体免疫系统，抵抗癌瘤的侵袭，这主要是从体液方面来实现。Jaynes等报道以CecropinB为蓝本，合成一种新型的抗菌肽，不仅对细菌、真菌和原虫有较强的穿透作用，而且对肿瘤细胞有明显的杀伤作用；Chen JY等[13]还证实抗菌肽Epinecidin-1抑制人白血病细胞的增殖，诱导细胞凋亡；赵瑞君等[14]报道家蝇成虫抗菌肽对肿瘤细胞109、K562、Daudi及T24的有效杀伤力都在85%以上，
本实验通过对中华大蟾蜍乙醚刺激获得皮肤分泌物，利用分离凝胶过滤层析和反向高校液相色谱层析两种分离纯化方法，获得中华大蟾蜍抗菌肽。实验结果显示，中华大抗菌肽除了具有抗菌效果，而且对大肠癌细胞SW480同样具有很好的抑制作用。我们利用细胞形态学的方法，在倒置显微镜观察到细胞的一些变化，当抗菌肽浓度达到0.1mg/mL时细胞结构发生明显的变化，细胞贴壁性下降，细胞变小，边缘不光滑，细胞间隙明显增大，当抗菌肽浓度达增大到0.3mg/mL和0.5mg/mL时，只能观察到细胞碎片的存在。我们还利用MTT法研究中华大蟾蜍抗菌肽对大肠癌细胞SW480生长抑制作用，结果显示，抗菌肽浓度在（60～200）μg/mL时，中华大蟾蜍抗菌肽对SW480细胞抑制率成量-效关系，而当抗菌肽达到200μg/μL以上的浓度时，对癌细胞的抑制率增长比较缓慢。
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（收稿日期：2011-10-28）
