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【摘要】 目的 构建骨髓间充质干细胞/骨基质明胶复合体修复大鼠桡骨节段骨缺损,为骨组织工程中制备组织化骨提供理论依据。方法 制备成MSCs/BMG复合体和桡骨缺损模型。实验组为A组:MSCs/BMG组;对照组:B组:BMG组;C组:MSCs 1×10�6/ml组。每组都设置2、4、8、12周四个时间点进行取材。观察术肢X射线放射学、免疫组织化学等检测骨缺损的修复情况。结果 X射线放射学评分4、8、12周各组均有明显差异(P[1]预言有可能在一种合适的生物相容性材料上种植种子细胞并形成能被移植成骨的新组织。此后一些研究使用单纯的种子细胞和单纯的生物材料修复骨缺损,虽然取得了一定的成果,但是长期效果并不理想。直到1987年Bob Langer和Joseph Vacanti在其实验的基础上提出了组织工程学,这为修复骨缺损提供了一个新的思路。本实验将BMSCs与BMG复合培养构建组织化骨以修复大鼠桡骨节段性缺损,为骨组织工程进一步发展提供理论及实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及试剂 1月龄健康雄性SD大鼠10只(体质量120~140 g),用于分离培养MSCs;另取2月龄(体质量200~250 g)的SD大鼠72只,用于体内实验。动物由辽宁医学院实验动物中心提供。SD大鼠骨髓间充质干细胞,骨基质明胶,系在辽宁医学院完成。Ⅰ型胶原抗体由武汉博士德公司提供;低糖DMEM培养基由Gibco生物工程公司提供。胎牛血清由北京华美生物工程公司提供。
1.2 实验方法
1.2.1 松质骨骨基质明胶的制备 取牛股骨下端松植骨去除骨髓、软组织和关节软骨,用大量蒸馏水清洗,参照Urist[2]的BMG 制备方法制备牛松质骨BMG。冻干消毒保存备用。
1.2.2 种子细胞的获取 ①大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养:取4周龄,体质量在120~140 g的SD大鼠,100 g/L水合氯醛麻醉,750 ml/L乙醇浸泡20 min,无菌条件下取出两侧肱骨和股骨,刮除软组织、骨膜和干骺端的软骨部分,剪去骨骺端,参照Jun Yao[3]的实验方法进行原代培养;②骨髓间充质干细胞的标记:取第3代72 h MSCs,吸除旧培养液,用PBS冲洗2次,加入Brd-U终浓度为10 μmol/L的完全L-DMEM培养基继续培养72 h。
1.2.3 细胞-支架材料复合体的体外构建 参照王涛[6]等的实验方法,取出Brd-U标记的第3代MSCs,弃去含有Brd-U培养液,PBS洗3次,尽量将残余的Brd-U洗掉。0.25%胰酶-EDTA常规消化并收集细胞,分别以1×10�5/ml、5×10�5/ml、1×10�6/ml、5×10�6/ml四种密度接种到BMG(5.0 mm×1.5 mm×1.5 mm)材料上,体外培养7 d,制备成MSCs/BMG复合体。
1.2.4 骨缺损模型的制备及实验分组 100 g/L水合氯醛腹腔麻醉后(3 ml/kg),无菌暴露双侧桡骨中段按照长骨缺损临界值[9]制成5 mm节段性缺损,实验过程中测量其桡骨中段直径为(2.0±0.5)mm,缺损处植入MSCs/BMG复合体,实验组为A组:MSCs/BMG组;对照组:B组:BMG组;C组:MSCs 1×10�6/ml组。均不做内外固定,逐层缝合伤口。术后每日
观察动物情况并肌注2万U庆大霉素,连续3 d。实验各组12只动物;每组均设置2、4、8、12周四个时间点进行取材,各时间点每组取3只大鼠,进行结果分析。
1.3 实验结果检测
1.3.1 术后动物生活状态的观察 手术后观察动物的饮食与活动状态以及伤口的愈合情况。
1.3.2 X射线检测缺损修复情况 于手术后第2、4、8、12周每种浓度各取3只大鼠,骨缺损区正位行X光拍片并按照Gray[4]标准进行结果分析。
1.3.3 Ⅰ型胶原蛋白的免疫组织化学染色 取上述2、4、8、12周各时间点的组织包块,作8 μm厚切片。按照产品说明书,将石蜡切片脱蜡至水,3%H�2O�2室温孵育,以消除内源性过氧化物酶。经pH 6.0的枸橼酸缓冲液中行抗原热修复,5%正常山羊血清封闭后加入1:100稀释的一抗(Ⅰ型胶原蛋白),4℃过夜。滴加生物素标记的二抗37℃孵育30 min,滴加ABC试剂37℃孵育30 min后DAB显色,常规脱水,透明,封片。以上各步骤军用PBS冲洗,同时用PBS代替一抗设置阴性对照。并对免疫反应结果作图像分析,测定平均灰度值。
1.4 统计学分析 实验所得数据以均数±标准差(x±s)表示。两组间比较采用q检验。P[5]报道一致;单纯的BMG虽然可以修复骨缺损,但是效果远没有MSCs/BMG复合体好。Vacanti等[6]用成骨细胞与PGA复合培养构建工程化骨,发现有新骨生成。Perka等[7]发现这种工程化骨对骨缺损有很好的修复作用,Orii等[8]在实验中证明,β-TCP复合骨髓基质干细胞诱导的成骨细胞可以形成完整的骨块。这是因为三维载体材料可以为植入细胞提供并保持一个生长的空间微环境,促使细胞的增殖分化,从而加速对缺损的重建[9]。Shang等[10]通过实验证实新生骨组织是由工程化骨中的种子细胞形成的。本实验结果显示实验组各时间段的成骨效果均优于对照组。单纯的BMG虽然可以对缺损局部正常存在的MSCs提供支架和生长的空间,并在BMG中含有的BMP的诱导下定向分化为成骨细胞,但是此类存在的干细胞数量太少,无法满足成骨要求,成骨与材料的吸收速率失调。骨组织的重建是一个系列性的复杂过程,首先需要把种子细胞植入或者招募到缺损部位[11],在局部微环境的成骨诱导下,向成骨性细胞分化,然后成骨细胞进一步发生至成骨细胞钙盐沉积到基质上[12]。本实验的实验组大量复合到载体中的MSCs在BMP和缺损局部一些生长因子的诱导下,基本能够满足修复骨缺损的要求。
参 考 文 献
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